免疫応答やスリープ中の定量的測定

本実験の全体的な目的は、ショウジョウバエにおける睡眠と免疫機能を評価することです。まず、感染させたハエの自発運動量を記録して睡眠を測定し、次に感染させたハエをホモジナイズして希釈し、LB寒天培地に塗布して生存率を測定します。増殖したコロニー形成単位（CFU）の数は、ハエが感染を排除する能力を示します。

次に、NF kappa b ルシフェラーゼレポーターを含むトランスジェーンを発現している感染させたハエを、ルシフェラーゼの基質であるluciferianを含む96ウェルプレートに加えます。kappa b ルシフェラーゼのリアルタイム測定により、感染中の NF kappa B シグナル伝達経路の活性化と、それに伴う睡眠生存結果が示されます。細菌の排除と NF KB レポーター活性の測定は、免疫機能と行動の間の分子的な関連性について、メカニズム的な知見を提供する指標となります。

一般的に、この手法に不慣れな人は、ハエに安定して手動で感染させる方法を習得するまでに時間と練習が必要なため、苦労することがあります。QPCRなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、生存しているハエにおいてNF Kappa B活性をリアルタイムで連続的に測定できることです。まず、成虫が環境条件に適応するよう、蛹後期のdrosophila培養物を3〜4日間インキュベートすることから始めてください。

ここで、概日時計が免疫応答および行動に及ぼす影響を排除するため、ハエを定常光下に置きます。次に、1日から4日齢のハエをアクティビティモニターに導入します。モニターは、予定された感染の1日前から、感染前の最低3日間、その活動量を記録します。

滅菌済みのピペットチップでSIAコロニーを1つ選び、5 mLのLB培地が入った培養チューブにチップを浸して、無菌操作を確認します。細菌を加えないコントロール用の模擬培養液を作成することを忘れないでください。翌日、細菌が対数増殖期に達するまで一晩培養します。

培養液の600 nmにおける吸光度を測定します。2つ目のQ vetをブランクとして使用してください。吸光度が0.5から1.0の範囲になったときが継代のタイミングですが、必要に応じて培養時間を延長してください。

次に、ショウジョウバエに感染させるための細菌溶液を調製します。細菌をPBSで希釈し、600 nmでの吸光度が0.1になるように調整します。その後、注入コントロール用の食用色素を添加します。

細菌をLB培地で置換します。両方の溶液を氷上で保存してください。次に、マイクロピペットプラーを使用して、解剖顕微鏡下で先端を細くした注入針を作成します。

精密ピンセットを使用して各針の先端を切り取り、吸引によって注入液を満たすのに十分な大きさでありながら、ハエへのダメージを最小限に抑えられる程度の開口部にします。ガラス針をチューブで3 ccのプラスチック製シリンジに接続します。注入液の流れは手動で制御します。

シリンジ装置を感染注入とコントロール注入の両方に使用するため、ゴムチューブが注入液で汚染されないように注意してください。キムワイプを使用して、注入培地の流れを確認します。注入を成功させるための2つの重要なポイントは、最適な針のサイズを使用することと、針とシリンジの間を確実に密閉することです。

注入システムが完全に準備できたら、二酸化炭素を最小限に流してハエを麻酔し、麻酔状態が5分を超えないよう迅速に作業を進めます。次に、ガラス針を背側胸部の後胸骨上の領域に刺し、ハエに注入します。注入液が広がる際に食用色素が見えることで、注入培地がハエ内に導入されたことを確認します。

開始する前に、この手順で使用するすべての資材が少なくとも1日前にオートクレーブ滅菌されていることを確認してください。LV寒天培地を用いて10 cmのシャーレを準備します。実験当日、ショウジョウバエを麻酔し、1.5 mL遠心チューブに入れます。

実験条件ごとに、1グループ10匹以上のハエを最低2グループ用意します。また、特に抗生物質耐性のない細菌株を使用する場合は、感染させていないハエの対照群も用意してください。溶液を充填したチューブはすべて氷上に保持します。

次に、ハエが導入された各チューブにLB培地を400 µL加えます。汚染を防ぐため、火炎滅菌を行った状態で、小さなパールを使用してハエをホモジナイズします。次に、カットしたピペットチップを用いて、ホモジナイズ液を200 µLずつ10倍段階希釈します。

sia感染直後にホモジネートを作成した場合は1:1,000まで希釈し、感染24時間後のホモジネートの場合は1:100,000まで希釈します。次に、最も希釈倍率の高い2つの希釈液を、ガラスボールを用いて均一に分散させながら10 cmプレートに播種し、プレートを一晩インキュベートします。翌日、直接観察またはコロニーカウントソフトウェアを用いて、プレート上のコロニー数を計測します。

次に、フライ1匹あたりのコロニー形成単位数を算出します。このアッセイでは、適切なタイミングでkappa bルシフェラーゼレポーターを導入したトランスジェニックフライを使用します。また、このアッセイには、前節で述べた注入用として調製したSCIAなどの培養細菌が必要です。

ハエを実験用の照明条件に慣らします。この例では、羽化後1〜4日のkappa b luciferaseハエを5% sucrose、2% agar含有の餌培地が入ったバイアルで飼育し、2日間持続光下に置きます。次に、ハエ用の96ウェルマイクロプレートを準備します。

各ウェルに2層の餌を満たします。まず培地として、5% sucrose、2% agar溶液を各ウェルに300 µLずつ加えます。プレートを細かいメッシュ状の布で覆い、最大1時間かけて十分に乾燥させます。

次に、5% sucrose、1% agar、および2 mM Luciferを含む上層を、各ウェルに50 µLずつ加えます。Luciferは光感受性があるため、プレートを暗所で乾燥させ、以降の操作においてもプレートへの光照射を最小限に抑えてください。

アガーが冷却されたら、プレートを透明な粘着フィルムで覆います。次に、細い針を用いて、各ウェルの上のフィルムに2箇所ずつ穴を開けます。これらの穴により、空気の交換と気体麻酔が可能になります。

次に、ハエを投入しやすくするため、鋭利な刃と定規を用いて、各列の間に切り込みを入れます。ハエを二酸化炭素で麻酔し、各ウェルに1匹ずつ、列ごとに投入します。ハエがフィルムに張り付いた場合は、無理に動かさず、自力で脱出できるまで待ちます。

マイクロウェルプレートを、定光条件下で8〜24時間インキュベーターに戻します。ウェルに固定されたハエを麻酔するには、低圧二酸化炭素ラインに取り付けたマイクロピペットチップを使用します。ガスが有害にならない低圧であることを確認し、通気孔の直上にマイクロピペットチップを配置して、8匹ずつのグループで個別にハエを麻酔させます。

各個体のハエをCO2パッドに移し、既述の手順に従って細菌を感染させる。その後、各個体を元のウェルに戻し、マイクロプレートを再密封する。温度管理された室内の定時照明条件下で、ルミノメーターを用いて各個体のルミネッセンスを測定する。

プレートをスタッキングカセットにセットし、ショウジョウバエを含むプレートを透明なブランクプレートで挟むように積み重ねます。ルミノメーターを製造元の仕様に従ってプログラミングし、最低24時間は1時間ごとに測定値を収集します。この例では、検出器は各ウェルを10秒間読み取るように設定されています。

完了後、データファイルをスプレッドシートにエクスポートし、結果をグラフ化して標準的な解析を行います。例示データを用いて解析が可能です。1ウェルあたり3回の測定値から秒あたりのカウント数を平均化します。

Canton S 野生型ショウジョウバエと、NF kappa B 遺伝子を欠損した relish. E 20 変異体ショウジョウバエを、持続光条件下で2台の活動量モニターに導入し、sia を感染させました。この例では、感染によって睡眠が促進されました。

relish E 20変異体は、感染後、Canton s.対照群のハエよりも睡眠時間が短かったことが明らかになりました。以前の知見と一致して、relish E 20変異体は野生型ハエと比較して、感染後速やかに死に至りました。

無菌コントロール注射後のハエのほとんどが生存したことから、ハエは注射による損傷ではなく、感染によって死亡したことが示された。relish変異体は非常に早く死亡したため、感染後の細菌量を確認するための実証にはCanton s株のハエのみを使用した。Siaは感染24時間後もハエの体内で増殖し続けた。

ルシフェラーゼのリポーター活性は、個々の個体間およびデータポイントの成功率間で大きな変動を示しました。信号はハエ体内のすべての組織から得られますが、すべての組織が同量の信号を発することは想定されておらず、またハエの動きによって検出器に対する組織の可視性は変化します。この例では、ハエに感染させ、ハンドリング操作のみを行った対照群と比較しました。

死亡したハエは、各群の解析から除外した。Kappa b Luciferaseレポーター活性は、感染後に定常的に上昇した。また、無菌的な損傷後においても、Kappa b Luciferaseレポーター活性は定常的に上昇した。

ピーク活性は、負傷後および感染後のいずれにおいても約12時間後でした。このビデオを視聴することで、感染後のSSOにおける免疫機能と睡眠の定量化方法について十分に理解できるはずです。睡眠、生存率、時間、細菌のクリアランス、およびuncopy転写レポーターのリアルタイム活性を測定することが可能です。