用ピギーバックMultibarrel電極の製造と使用

本手順では、神経活動の記録と同時に、脳内のマイクロ回路へ薬理学的薬剤をイオン電気泳動法を用いて投与することを目的としています。まず、単一細胞記録用のシングルバレルガラス電極を引き、先端を曲げます。また、マルチバレルガラス電極を引き、先端を目的の直径まで破断させます。

次に、2つの電極を組み立てます。最終的に、作製した電極は細胞外in vivo記録に使用され、必要に応じて薬理学的薬剤を局所的に投与して神経マイクロ回路を操作することができます。こんにちは、私はDr. Achim Kluです。本日は、当研究室にてピギーバック・マルチバレル電極の作製方法を解説します。

これらの電極を使用して、神経アゴニストおよびアンタゴニストをニューロンの微小環境に導入し、それによってin vivoでニューロンの神経回路を操作することが可能です。こんにちは、Dr.An Zillowです。Dr.Ah him Crowの研究室のポスドクを務めており、本日はその手順を実演します。シングルバレル電極については、フィラメントを入れたシングルバレルガラスキャピラリーを使用し、先端の直径が約1〜2 µm、シャフトの長さが10〜12 mmになるまで引き出してください。

3 Mの塩化ナトリウムで満たし、0.9%生理食塩水中で標準的なΩメーターを用いて、抽出した電極の抵抗値を随時確認します。電極を塩類溶液で満たすと、溶液がすぐに乾燥して電極が使用不能になるため、この試験のみを行ってください。

ピギーバック作製に使用しない電極をいくつか準備します。完全なマルチバレル電極を作成するには、ガラスを引っ張り、先端の全径が約 10 µm 以下になるようにピペットチップ状に成形します。適切に引き伸ばされたチップを持つ電極が、成功の鍵となります。

チップは細長くであることに加え、適切に硬い状態で、目的のチップ径まで容易に折れる必要があります。正しい直径への調整は次のステップで行います。したがって、プーリング工程においては、正確なチップサイズよりも、電極チップが細長く比較的薄いという全体的な形状の方が重要です。

次に、シングルバレル電極を約45度の角度で保持し、先端を下に向けた状態で、比較的速く炎の中を通過させます。電極先端から約10 mm離れた遷移領域のガラスを炎で溶かし、約20度曲げるようにします。マルチバレル電極をガラススライド上の造形粘土の上に置き、顕微鏡ステージに挿入します。

スライドホルダーを使い、顕微鏡ステージのXYマニピュレーターを用いて、電極先端をプレキシガラス片にそっと押し当てます。顕微鏡の接眼レンズを通して、先端が破断する様子を確認してください。ここでは電極アセンブリのセットアップを示しています。

マルチバレル電極は、顕微鏡ステージ上のガラススライド上に固定されています。一方、シングルバレル電極は手動の多軸マニピュレーターで保持されており、これによりユーザーはシングルバレルピペットを非常に精密にマルチバレルピペットへと下降させることができます。シングルバレル電極を、5本のバレルの配置によって形成されたマルチバレル電極の溝に直接導入し、その先端がマルチバレルチップの先端から約5～10 µm突出するように調整します。

シアノアクリレートを用いて、2本の電極のシャフトを接着します。先端から最も遠い位置から開始し、接着剤をつけた爪楊枝を電極シャフトに沿って、先端方向へゆっくりと動かします。電極先端に近すぎる位置に接着剤を塗布すると、先端が詰まり、電極が部分的または完全に機能しなくなるため注意してください。

少量の歯科用セメントを混ぜ合わせます。約15分間乾燥させます。その後、完成したピギーバック電極を慎重に取り出します。

まずマイクロマニピュレーターホルダーから外し、次にガラススライドから取り外します。電極を使用する直前に、各バレルにそれぞれの薬剤をバックフィルする準備をします。5バレルの構成のうち、外側の4つのバレルに任意の4種類の薬剤を満たし、中央のバレルにはバランスバレルとして3 Mの塩化ナトリウムを満たします。

次に、シングルバレル記録電極に3 Mの塩化ナトリウムを満たします。その後、イオン導入ポンプモジュールをオンにし、すべてのバレルをテストします。各ポンプモジュールの電極テスト機能により、電極バレルが深部脳記録に使用可能であるかを確認できます。

シングルバレル記録電極と共に組み立てられた完成後の5バレル電極は、約7 mmの長いシャフトを有しています。イオン導入法では、グリシン受容体拮抗薬などの薬剤を用いてグリシン抑制を遮断するために、いくつかのシナプス作動薬および拮抗薬が一般的に使用されます。一般に、トリックナイン塩酸塩はニューロンの発火頻度を増加させます。

このサンプルデータは、聴覚ニューロンの放電率対強度の関数を測定したものであり、動物の耳に提示された強度が漸増する正弦波音刺激に対する応答を示しています。厳格なnineを適用する前は、音が大きくなるにつれてスパイク率が高くなりました。ニューロンの率-強度関数は、低いスパイク率を示しています。

15 nano ampsの初期イオン導入電流を印加すると、放出電流がわずかに増加します。放出電流を漸増させると、ニューロンのグリシン受容体が段階的に遮断され、その結果、発火率が漸増します。45 nano ampsの電流において、そのニューロンのすべてのグリシン受容体がストリクニーネ塩酸塩によって遮断されたと考えられます。

放出電流をさらに増加させ、より多くのニコチンの放出を試みましたが、さらなる変化は見られませんでした。イオン導入終了後のニューロンの放電率レベル関数において、神経応答がベースラインまで完全に回復するまでには約25分かかります。この回復過程は、放出された薬剤の種類と量に依存します。

薬剤は記録部位の周辺に拡散し、隣接するニューロンの受容体も遮断する可能性があることに留意することが重要です。このビデオを視聴することで、記録電極とマルチバレル薬剤電極を組み合わせ、低ノイズの深部脳記録を行う方法と、最大4種類の薬理剤を時間制御して投与する方法について十分な理解を得ることができるはずです。