単離、特徴付けと二つの異なる方法を使用して永久歯に由来するヒト歯髄幹細胞の分化の比較

本手順の全体的な目的は、2つの方法を用いて、永久歯からヒト歯髄幹細胞を単離、特性評価および分化させることです。これは、健全な埋伏智歯を採取し、まずセメントエナメル接合部付近で切断することで達成されます。歯科パルプ幹細胞（D PSCs）は、2つの異なる方法で単離されます。

第一の手法では、ポリープ組織をcollagenase type oneおよびdisc space solution中でインキュベートし、酵素的に消化させます。ここではこれをedと呼びます。第二の手法の単離方法では、ポリープ組織を消化処理せず、そのままフラスコに投入します。

このようにして、dpssが組織からフラスコへと遊走し始めます。これらの細胞は、アウトグロース（outgrowth）分離法に由来するため、OGと呼ばれます。手順の第2ステップは、フローサイトメトリーを用いた幹細胞の同定です。

手順の3番目のステップは象牙芽細胞分化の誘導であり、最終ステップは、アリザリンレッド染色およびqPCRによる2群間の象牙芽細胞分化の比較評価です。私はRian研究所幹細胞・発生生物学部門のRA Kdeです。本日は、2つの手法を用いたヒト間葉系幹細胞の単離、特性評価、および比較分化について解説します。

こんにちは、リオ研究所のRezaian博士です。私たちはヒト歯髄幹細胞に関するプロジェクトに取り組んでいます。これらの細胞は間葉系幹細胞の一種であり、痛みや侵襲性を最小限に抑えて容易に採取することが可能です。

間葉系幹細胞は、プラスチック接着能、コロニー形成能、および多分化能によって定義されます。幹細胞部門のDr.Amiです。当研究所のラボでは、研究および将来的な応用のために幹細胞を単離する目的で、本手順を用いています。

再生医療において、将来的な幹細胞療法の源としてこれらの幹細胞を利用するための最初の手順は、ヒト組織から幹細胞を単離するための最適なプロトコルを選択することです。この目標を達成するためには、異なる幹細胞単離条件下における細胞挙動の特定の側面を調査することが極めて重要です。まず、歯髄の酵素的解離、または組織移植片からの幹細胞の外向増殖（outgrowth）のいずれかの方法を用いて、ヒト歯髄幹細胞を単離します。

次に、それらを特性解析し、原芽細胞に分化させます。それでは始めましょう。まず、hyaluronidaseとcollagenase Type Iの両方をPBSに溶解させます。

その後、0.2 micronのシリンジフィルターを用いてろ過します。両方をコニカルチューブに回収してください。次に、penerとPBSを加えて最終濃度に調整します。

健全な親知らずを、滅菌条件下で冷やした基礎培地を用いてラボに搬送します。分析前に、70% ethanolで歯の表面を清掃します。歯の表面から不純物が完全に取り除かれていることを確認してください。

滅菌済みの歯科用ディスクを用いて、歯のセメントエナメル接合部付近を切り出し、髄腔を露出させます。歯科組織の過熱を防ぐため、切断作業はゆっくりと行う必要があります。次に、Scarpaブレードを使用して、歯冠から歯髄組織を慎重に分離し、歯髄組織を1〜2 mmの断片に切り分けます。

歯髄組織の小さな断片を1 mLの酵素溶液に移し、37 °Cで1時間置く。その際、歯髄組織の分解を促進するため、30分ごとにボルテックスミキサーで撹拌する。その後、70 µmのセルストレーナーに通して大きな凝集体を除去する。次に、PENERを含むPBSを加え、1,200 RPMで5分間遠心分離を行う。

上清を慎重に除去します。次に、プレートを増殖培地で懸濁して培養フラスコに移し、培地を加えます。その後、インキュベートします。

アウトワーク法において、細胞がコンフルエントになるまで3日ごとに培地を交換します。切断工程を繰り返します。歯の切断とは、組織を1〜2 mmの断片にすることです。

その後、それらを培養容器に入れます。増殖培地を加え、インキュベートします。その後の細胞外方増殖のために、増殖培地の全量がすべての断片の接着をサポートできる量であることを考慮する必要があります。

アウトグロースを確認した後、細胞がコンフルエントになるまで3日ごとに培地を交換します。免疫表現型解析では、2種類のD PSCsの両方を、PEまたはFITC標識抗体とともに4°Cの暗所で30分間インキュベートします。その後、PBSを加え、1,200 RPMで5分間遠心分離します。

上清を除去し、プレートをPBSで再懸濁させた後、フローサイトメーターを用いて表面マーカーの評価を行います。両方のタイプのDPCを3代継代します。その後、トリプシン処理を行い、60%のコンフルエンシーで6つの赤い培養皿に播種し、PMを歯原性分化誘導培地に交換します。3つのウェルにはPMを添加し、陰性対照として保持します。

3日ごとに培地を交換し、21日目にPBSで細胞を洗浄します。その後、1ウェルあたり1 mLの10%ホルマリン溶液を用いて、室温で15分間固定します。

15分後、固定液を慎重に取り除き、蒸留水で細胞を3回洗浄します。次に、水を1 mLのred alza赤色染色液に置換します。20分後、過剰な染料を取り除き、脱イオン水で細胞を4回洗浄します。

次に、細胞の乾燥を防ぐため、ウェルあたり1 mLの水を加えます。染色の後、顕微鏡下でコントロールと比較すると、3つのレールが赤色に変化していることが確認できます。高倍率で観察すると、赤色染色の定量化のために、細胞周囲の色吸収を確認することができます。水を除去した後、ウェルあたり1 mLの10%酢酸を加え、振盪しながら30分間インキュベートします。

次に、セルスクレイパーを用いてプレートから細胞を静かに回収します。その後、それらを別々のチューブに移します。30秒間激しくボルテックス（VOR）します。

その後、85 °Cで10分間加熱します。蒸発を防ぐためにチューブをParaFilmで密閉し、氷上で5分間冷却します。次に、20,000 ×gで15分間遠心分離します。その間に、規定のプロトコルに従ってアルザリンレッドの標準連続希釈液を調製します。

遠心分離後、上清を除去し、新しいチューブに移します。10% ammonium hydrocyteを用いてpHを中和します。その後、標準品およびサンプルを96ウェルプレートに加えます。

ウェルプレートを用い、405 nmで吸光度を測定し、標準的な段階希釈に基づいてデータを分析します。ここでは、10日目、15日目、18日目に酵素的解離によって単離されたDPSCsと、5日目、10日目、13日目、18日目に過成長したDPSCsを確認できます。Case 3における両タイプのDPSCsは、サイズと形態がほぼ同一です。免疫表現型解析の結果、CD 44、CD 73、CD 19などの間葉系幹細胞マーカーが陽性であり、CD 34、CD 45、CD 11 Bなどの造血系および内皮系マーカーは陰性であることが示されました。興味深いことに、CD 105およびCD 146の発現は、DPSCEDと比較して過成長したDPSCsでより高くなっていました。象牙芽細胞分化21日目におけるアリザリンレッド染色の定量結果では、コンデンタルチップを用いない幹細胞と比較して、DPSCEDでより多くのカルシウム沈着が認められました。

qPCRの結果はまた、D-P-S-C-Dにおいて、ミネラル化マーカーであるMEPおよびALPの発現が、分化前の歯科幹細胞と比較して有意に高いことを示しています。同時に、これら両遺伝子は分化過程で制御されており、また、歯牙形成マーカーであるDSPPの発現も分化に伴い増加しました。しかしながら、分化細胞におけるDSPPの発現について、ED群とOG群の間に有意な差は認められませんでした。

以上で、歯髄の酵素的解離または組織外植片からの幹細胞の遊出による、ヒト歯科幹細胞の分離方法について解説しました。本手順がお役に立てば幸いです。皆様の実験での成功を願っております。

ありがとうございました。