ミニブタの滑液および骨髄由来の間葉系幹細胞の単離および細胞表現型
2016年7月2日
ミニブタの滑液と骨髄から分離され、注射器吸引を使用して非侵襲的に採取された間葉系幹細胞(MSC)を確立するプロトコルが提示されます。細胞表現型は、細胞単離後のフローサイトメトリーを使用し、MSCに由来する骨髄および滑液のin vitro培養を用いて行いました。
この手順の全体的な目標は、ミニブタから滑液と骨髄を非侵襲的に収集して、再生および免疫調節研究に使用する間葉系幹細胞を収集することです。この方法は、MSCで滑液を確立する方法や、骨髄MSCと比較してそれらを特徴付ける方法など、耳科医のMSC療法分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ミニブタの滑液および骨髄由来MSCの主要な特性を効果的に確立することであり、これは患者への適用に役立ちます。
この技術の意味は、滑液由来の MSC の集団が滑液腔内の運動患者で大幅に増加するため、さまざまな関節疾患の治療にまで及びます。この方法は再生医療への洞察を提供しますが、自己免疫疾患の研究などの他の研究にも適用できます。ミニブタMSCは自家であるため、免疫抑制はヒトに興味を持つかもしれません。
他の科学者に加えて、手順を実演するのは、私のレベル3のHyeon-Jeong LeeとWon-Jae Leeです。まず、麻酔をかけたミニブタを腸骨稜にアクセスできるように向けます。次に、かみそりまたはバリカンを使用して、腸骨稜の15平方センチメートルの領域を脱毛します。
次に、露出した皮膚をポビドンヨードと70%エタノールで交互に3回こすります。完全に乾いたら、滅菌ドレープを塗ります。次に、10ミリリットルの注射器にヘパリンをプレコートし、3〜4ミリリットルのリンスを使用します。
これにより、骨髄が抽出される間、骨髄が凝固するのを防ぐことができます。次に、腸骨骨稜で正確に、骨髄抽出器をヘパリン被覆シリンジにしっかりと取り付け、少なくとも5ミリリットルの骨髄を抽出します。抽出した骨髄から細胞を単離するには、まず、室温で15ミリリットルの円錐形チューブに同量のDPBSで細胞を希釈します。
次に、3ミリリットルの密度遠心分離媒体を2番目の15ミリリットルの円錐管にロードします。次に、希釈した骨髄4ミリリットルを密度遠心分離培地に慎重に移し、2溶液層を作成します。次に、チューブを400Gで室温で40分間遠心分離します。
目的の多国籍企業が中央の白い層に集められます。このレイヤーだけを吸引します。MNC層を15ミリリットルの円錐管に噴射し、7〜8ミリリットルのDPBSで希釈します。
次に、細胞を500Gで室温で10分間遠心分離します。上清を捨て、パレットに載せた細胞を10ミリリットルのDPBSで2回洗浄し、前の遠心分離サイクルを繰り返します。2回の洗浄後、MNCを2ミリリットルのADMEMに懸濁します。
次に、細胞を35mmの組織培養皿にロードし、加湿した5%二酸化炭素インキュベーターで摂氏38.5度でインキュベートします。48時間後、付着していない多国籍企業と一緒に培地を吸引します。次に、2ミリリットルの新鮮なADMEMを戻し、3日ごとに培地を交換しながらインキュベーションを続けます。
細胞が70〜80%の密度に達したら、新鮮なDPBSで培養物を洗浄します。次に、1ミリリットルの0.25%トリプシン-EDTAを摂氏37度で3〜5分間使用して、細胞を解離します。細胞を10ミリリットルのADMEMに集め、15ミリリットルの円錐管に移します。
その後、細胞を室温で300Gで5分間スピンダウンし、上清を捨てます。次に、収穫した多国籍企業を1ミリリットルの新鮮なADMEMに懸濁し、その密度を測定します。1/2から25百万のセルを4ミリリットルのADMEMでT25フラスコにめっきして仕上げます。
プレートと同じようにフラスコをインキュベートし、3日ごとに培地を交換します。骨髄採取の準備時に行ったように、大腿骨関節の上に皮膚の15x10センチメートルの部分を準備します。次に、滑膜関節を特定するために、皮膚の下の膝蓋骨と脛骨の稜を触診し、23ゲージの針が付いた3ミリリットルの注射器を関節に正確に挿入します。
穏やかな吸引を使用して、1/2から1ミリリットルの液体を抽出し、すぐに針を引き抜きます。滑液の量が小さすぎる場合は、DPBSでキャビティを洗い流し、DPBSで滑液を収集します。使用するDPBSの量は、滑膜腔のサイズによって異なります。
滑液の最適量は、健康な関節では制限されます。体積は、その関節のサイズと病理学的状態によって異なります。滑液から細胞を単離するには、室温で15ミリリットルの円錐形チューブ内の等量のDPBSで液体を希釈します。
次に、40ミクロンのナイロン製セルストレーナーで希釈液をろ過して、破片を移動させます。次に、さらに10ミリリットルのDPBSを加え、懸濁液を室温で10分間400Gで遠心分離します。次に、上清を捨て、DPBSを使用して細胞を2回洗浄します。
洗浄したセルパレットを2ミリリットルのADMEMに吊り下げます。その後、MSCで実証されたように細胞の培養を進め、MSCはミニブタの骨髄および関節滑膜関節から成功裏に単離され、in vitroで拡大されました。
滑液由来MSCの形態は骨髄由来MSCと類似しており、どちらも線維芽細胞性紡錘体形状をしており、均一に付着しています。MSCは、3回目の継代培養が完了した後、アルカリホスファターゼ染色に対して陽性の発現を示しました。次に、両方の培養物で表面マーカーを分析しました。
予想通り、両タイプのMSCはCD29、CD44、およびビメンチンを有意に発現しました。対照的に、CD34とCD45の発現は陰性で低かった。これらの結果は、滑液から単離された細胞を含む特徴的なMSCを通じて得られた結果と同一でした。
このビデオを見た後、あなたは非侵襲的に滑液と骨髄を吸引する方法をよく理解しているはずです 彼らのMSCをミニブタから分離するために、そしてこのMSCの比較と表現型をどのように実行するか。この手順を試みるときは、慎重な触診によって決定された腸骨稜と滑膜の客観的な点を特定することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、変形性関節症や関節リウマチのモデルのような他の方法を実行して、骨髄MSCだけでなく滑液MSCからだけでなく、滑液MSCも軟骨または骨の開始と免疫抑制のための同じ種類の能力を持っているかどうかなどの追加の質問に答えることができます。
その開発後、この技術は、関節炎患者の発作または炎症を起こした関節に由来するMSCを特徴付けるのを助けることにより、関節疾患の自家療法を進歩させました。
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概要
本記事では、ミニピッグの骨髄および関節液から間葉系幹細胞（MSC）を非侵襲的に単離および培養するための詳細なプロトコルを紹介します。本研究では、MSCの回収、培養、および表現型解析の手法を提示し、関節液由来MSCと骨髄由来MSCの類似性を明らかにするとともに、再生医療および免疫調節における潜在的な応用について考察します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 幹細胞生物学
- 再生医療
- 細胞療法
背景
- MSCは、骨髄や滑液を含むさまざまな組織から単離することができます。
- 滑液由来のMSCは、多系統分化能および免疫調節能を示すことが明らかになっています。
- 非侵襲的な採取方法は、研究および臨床応用の両方において価値があります。
- ミニピッグは、関節疾患および治療のトランスレーショナル研究における適切なモデルとなります。
研究目的
- ミニピッグの骨髄および滑液からMSCを単離するための、簡便で非侵襲的なプロトコルを確立すること。
- 両方のソースから得られたMSCの形態と表現型を比較すること。
- 関節疾患における自己MSC治療および免疫調節研究の基盤を提供すること。
使用した手法
- 麻酔下にあるミニピッグの腸骨稜からの骨髄および大腿脛骨関節からの滑液の非侵襲的吸引。
- 密度勾配遠心分離法およびろ過法を用いた細胞分離。
- 制御された条件下でのMSCのin vitro培養および拡大。
- フローサイトメトリーによる表面マーカー（CD29, CD44, Vimentin, CD34, CD45）を用いたMSCの表現型解析。
主要な結果
- ミニピッグの骨髄および関節液の両方から、MSCを正常に単離および拡大培養できた。
- 関節液由来MSCは、骨髄由来MSCと同様の線維芽細胞様形態および接着性を示した。
- 両方のMSCタイプにおいてCD29、CD44、およびVimentinの発現が認められ、CD34およびCD45の発現は低値または陰性であった。
- 継代後のアルカリフォスファターゼ染色は陽性であり、MSCとしての同一性が確認された。
結論
- 滑液は、ミニピッグにおけるMSCの貴重で非侵襲的に採取可能な供給源である。
- 確立されたプロトコルにより、両方の供給源からMSCを効果的に単離、培養し、表現型解析を行うことが可能となる。
- この手法は、関節疾患や免疫調節に対する自己MSC療法のさらなる研究および開発を支援する。
よくある質問
産業界における重要性
ミニブタの滑液および骨髄から間葉系幹細胞（MSCs）を非侵襲的に単離・フェノタイピングすることで、再生および免疫調節研究に向けた細胞源の堅牢な比較分析が可能になります。このワークフローは、ダウンストリームのアプリケーションに標準化され再現性のあるMSC集団を提供することにより、初期段階のターゲット検証をサポートし、トランスレーショナル研究のリスクを軽減します。このアプローチは、関節疾患および自己免疫疾患を標的とした細胞療法の前臨床モデル選択およびポートフォリオ推進における予測信頼性を高めます。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 異なる組織由来のMSCを直接比較し、機能的なターゲットの妥当性を検証することが可能になります。
- 滑膜由来および骨髄由来のMSCの表現型の等価性を確認することで、生物学的なリスク低減をサポートします。
- MSCの免疫調節能および再生能に関する仮説検証を促進します。
- 疾患関連システムにおけるメカニズム研究の基盤を提供します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの標準化と再現性のために、検証済みMSC集団を提供します。
- 堅牢なスクリーニング結果を得るため、フローサイトメトリーに基づく定量的なフェノタイピングを可能にします。
- 化合物評価のための、スケールアップ可能な均一な細胞系の調製をサポートします。
- ハイコンテントスクリーニングへの準備状況およびプラットフォームの再利用性を向上させます。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患に関連する前臨床モデルとMSCのソースを整合させ、トランスレーショナルな連続性を確保します。
- リスク調整に基づいた自己細胞治療候補の進展を可能にします。
- 表面マーカー解析および機能的アッセイを通じて、バイオマーカーの整合をサポートします。
- 細胞の同一性とソース間の比較可能性を確認することで、前臨床研究のリスクを低減します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本プロトコルは、関節疾患および自己免疫疾患モデルにおけるターゲット検証、アッセイ開発、およびトランスレーショナルリサーチに向けて標準化されたMSCを提供することで、創薬から前臨床研究までの継続的なプロセスへと統合されます。
- 探索生物学： 特性が十分に解析されたMSCを用いて、仮説検証およびパスウェイの解明を行うためのプラットフォームを提供します。
- スクリーニング： アッセイ開発および化合物スクリーニングのための、再現性のある定量的な表現型解析を可能にします。
- 分析： フローサイトメトリーに基づく表面マーカーデータを提供し、細胞集団の比較分析を実現します。
- トランスレーショナルリサーチ： 初期の探索から疾患関連モデルにおける前臨床検証まで、一貫した研究をサポートします。
- 組織内での再利用： 複数の研究にわたってMSCの単離および特性解析に利用可能な、再利用可能なワークフローを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：MSCベースの研究における予測の信頼性を高め、メカニズム上の曖昧さを低減する。
- 運用的価値：細胞の分離およびフェノタイピングを標準化し、再現性と拡張性を確保する。
- 戦略的価値：ゴー/ノーゴー判断の根拠を提供し、細胞治療パイプラインにおける資本効率を向上させる。
- ポートフォリオへの影響：リスク調整後の優先順位付けを可能にし、MSCベースの治療候補物質の開発を推進する。
実施上の検討事項
- 無菌的な組織操作およびフローサイトメトリー解析の専門知識が必要です。
- 遠心分離機、細胞培養設備、および分析機器へのアクセスが必要です。
- 分離およびフェノタイピングプロトコルのチーム間での標準化が求められます。
- 関節のサイズと液量に留意することで、さまざまな前臨床モデルに適応可能です。
- 健康な関節と疾患のある関節における滑液の得られる量によって制限されます。
バイオファーマ FAQ
Chapters in this video
0:05
Title
1:39
Collecting Bone Marrow from Minipigs
2:47
Isolation of Cells and In Vitro Cultivation
4:42
In Vitro Cultivation of Cells Isolated from Bone Marrow
6:18
Collecting Synovial Fluid and Cultivating Isolated Cells
8:19
Results: Bone Marrow- and Synovial Fluid-derived MSC Morphology and Cell Surface Marker Expression
9:23
Conclusion
