本手順の全体的な目的は、パッチクランプ記録を行うために、ラット脳からF1 F zero APA小胞を単離することです。まず、ラットから脳を取り出してホモジナイズします。次に、圧力を加えてシナプス領域を破壊します。

次に、シナプトソームをファイアル勾配の上に積層させます。最終ステップとして、digitoninおよびLとともにインキュベートし、パッチクランプ記録用の最終的な小胞を得ます。ミトコンドリアの重要な機能の一つは、酸化的にリン酸化によるATP産生です。

ATP生成を担う酵素は、ミトコンドリア内膜に位置するATP合成酵素です。ATP合成酵素の機能を詳細に研究するため、我々はSMVと呼ぶ特殊なサブミトコンドリア小胞を単離します。これらの小胞には、ATP合成酵素が裏返しの構造（インサイドアウト構成）で含まれています。

次に、これらのSMVをパッチクランプ電極で記録し、膜のリーク性を測定します。これにより、ミトコンドリアによるTP産生の効率がわかります。本日のこの手順の実演は、イェール大学の私の研究室のポストドクトラルフェローであるSylvia tiが行います。

本手順では、ラットを断頭して頭部を回収した後、皮膚を切開して頭蓋骨を露出させ、ハサミまたはロンソン剪刀で慎重に頭蓋骨を開けます。続いて脳を取り出し、小脳を除いた脳組織を細切したあと、単離緩衝液で処理し、5 mLのガラス製テフロンホモジナイザーに移します。組織を10回、合計で約5分間、緩やかにホモジナイズします。その後、ベンチトップ遠心機を用い、4 °Cで1,500 ×gにて10分間、サンプルを遠心分離します。

ミトコンドリアとシナプトソームを含む上清を回収し、ペレットを廃棄します。次に、ベンチトップ遠心機を用いて、4°Cで16,000 ×g、10分間、再度遠心分離を行います。その後、上清を廃棄し、ペレットを500 µLの分離バッファーで再懸濁させます。細胞破砕装置を用い、1,200 PSIの圧力を10分間かけて負荷し、その後急速減圧することでシナプトソームを破砕します。破砕したシナプトソームを、2つの層を形成する2種類の濃度のFialを含む遠心管に積層させます。

次に、チューブをSW 50.1ローターにセットし、4°Cで126,500 ×gにて20分間遠心分離します。超遠心機において、ペレット部分は精製されたミトコンドリアです。異なる密度の間の層は、破壊されていないシナプトソームです。

その後、単離バッファーを用いて、ベンチトップ遠心機で4°C、16,000 ×gで10分間遠心分離し、ペレットを洗浄します。次に、ミトコンドリアを200 µLの単離バッファーと等量の1% digitoninの混合液に再懸濁します。

氷上に15分間置きます。次に、分離バッファーを追加し、4°Cで16,000 ×gにて10分間遠心分離します。この手順を2回繰り返し、その後、ペレットを200 µLの分離バッファーで再懸濁し、10% Lybra PXミックスを2 µL加えて氷上に15分間置きます。

その後、混合物を単離バッファーとともに遠心管に層状に加えます。チューブをSSW 50.1ローターにセットし、4 °Cで182,000 ×gにて1時間遠心分離します。1時間後。

最終パレットを分離バッファー中で16,000 ×g、4°Cで10分間遠心分離して洗浄します。一般的な電気生理学装置には、アンプ、DigiData 1440を搭載したPC、Pclamp 10.0ソフトウェアと連携したアナログ-デジタル変換インターフェース、マニピュレーター、顕微鏡、除振台、およびファラデーケージが含まれます。まず、燃焼式ブラウンマイクロピペットプラーを用いて、ホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブからピペットを抽出します。

ピペットの最適な抵抗値は80～100 MΩの間である必要があります。生理的な細胞内液にサブミトコンドリア小胞を加えます。その後、同じ溶液でパッチクランプピペットを満たします。

室温でSMVのパッチクランプ操作を行った後、位相差顕微鏡で小胞を観察します。膜電位を-100 mVから+100 mVの範囲で各10秒間保持し、その際の活性を記録します。

記録されたデータは、アンプ回路を用いて5 kHzでフィルタリングされ、Clampfit 10.0ソフトウェアで解析されます。この図は、細胞質およびミトコンドリアから調製したライセートのブロットを示しています。上段のパネルは、細胞質タンパク質GA dhに対する抗体を用いたイムノブロットを示しています。

下段のパネルは、ミトコンドリア内膜タンパク質Cox fourに対する抗体を用いたブロットを示しています。ここでは、1 mM ATP添加前後の代表的なパッチクランプ記録を2つ示します。保持電位は+70 mVです。破線は0 pAを表しています。

各トレースは10秒間記録され、トレース間には10秒の間隔があります。ここでは、SMV存在下、およびTP非存在下と存在下における、A CMAインジケーターの蛍光強度の経時的変化の例を示します。このビデオを視聴することで、ミトコンドリア、およびF1 FO 80 TP Synthesを含むサブミトコンドリア小胞の単離方法について十分に理解できるはずです。さらに、小胞膜に電極を用いてI耐性シールを形成し、A TP Syntase複合体のチャネル活性を解析する方法についても理解を深めてください。