ミササイトメトリー：CyTOFマスメーターで毎日のチューニングと実行した細胞サンプルのためのプロトコル

この手順の全体的な目的は、CyTOF装置における適切な日常的なチューニングおよびサンプル分析を実演することです。まず、装置を組み立てて電源を入れます。次に、信号を最大化させるために、チューニング用の装置設定を最適化します。

これで、装置でサンプルを測定する準備が整いました。最終ステップとして、装置の洗浄とシャットダウンを行います。これにより、特定の時間的要件に従って、最適な細胞データを取得することが可能になります。

本手法の視覚的な実演は極めて重要です。日次のセットアップ、チューニング、および洗浄の手順は、複数のソフトウェア操作が同時に行われるため、マニュアルから習得するのは困難です。

適切なバックグラウンドレベルと信号強度への感覚を養うために、経験を積む必要があります。実験を開始する少なくとも15分前に、CyTOFソフトウェアプログラムを開き、instrument setupを選択してください。次に、card cageタブにあるheater onボタンをクリックし、スプレーチャンバーのマントルを200 °Cまで加熱します。

シリンジポンプのシリンジを、milli cube waterを満たした新しいシリンジに交換します。次に、各ポートから5% Citronで2回バックフラッシュを行い、ネブライザーを洗浄します。残留したCitronを除去するため、Milli Q waterで再度バックフラッシュを行います。

次に、アルゴンガスタンクのバルブを開くと、装置前面のアルゴンランプが点灯します。続いて、ネブライザーをメイクアップガス入口に取り付け、さらにネブライザーを液体導入チューブに接続します。装置セットアップウィンドウのRFGコントローラータブにある、ヒーティングマントルの白い開口部にネブライザーの端を挿入してください。

「start plasma」をクリックし、「okay」をクリックします。起動が完了した後、ポップアップウィンドウで再度「okay」をクリックします。次に、シリンジポンプの電源を入れます。

シリンジを補充する際は、一時停止ボタンではなく停止ボタンを押し、容量カウンターをリセットしてください。マスサイトメーターをキャリブレーションする前に、20分間ウォーミングアップさせてください。装置が安定したら、データ収集設定ボタンをクリックして、データ収集設定ウィンドウを開きます。アナライトタブにて。

周期表をクリックして同位体選択パネルを開きます。次に、マニュアルに記載されているDVS sciencesチューニング溶液に含まれる同位体を選択し、保存をクリックします。続いて、1回あたりの読み取り同位体数ボタンをクリックして、1回あたりの読み取り質量ウィンドウを開きます。

パルス数を選択し、新しい数値を入力してエンターキーを押すことでy軸のスケールを再設定します。次に、1 mLのグリーンノルム注入用シリンジにチューニング溶液を満たします。サンプルポートセレクターをloadに回します。

チューニング溶液を450 µL注入し、セレクターを注入（inject）に回します。このディスプレイにチューニング溶液のアイソトープがストリークとして現れ始めるまで待ちます。飛行時間（time of flight）の9,400から9,800の領域に現れるシグナルは、アルゴンガスに含まれるキセノンアイソトープによるものです。

次に、「masses per reading window」に戻り、緑色の再生ボタンをクリックします。各色の線は、「analytes」タブで選択された同位体を表しています。同位体レベルが安定したら、データ収集設定ウィンドウの「parameter」タブにあるドロップダウンメニューから、現在の選択電流を調整します。

開始ウィンドウで、finishに0を、enterに10を入力します。step valueに0.5を、settling timeに200を入力します。その後、saveをクリックします。

次に、「masses per reading」ウィンドウを再度クリックし、再生ボタンをクリックします。同位体の信号のピーク位置を確認した後、装置設定ウィンドウの「DAC channel setup」タブに移動します。下にスクロールして「current」に同位体ピークの値を入力してください。

「set actual current value」をクリックし、保存します。次に、ドロップダウンメニューを「make up gas」に変更します。開始ウィンドウに0.55、終了ウィンドウに0.95、ステップ値ウィンドウに0.05、そしてセトリングタイムウィンドウに200を入力します。

「保存」をクリックします。「読み取りあたりの質量」ウィンドウに戻り、再度「再生」をクリックすると、x軸にメイクアップガスの流量が表示されます。同位体信号がピークに達する値を確認し、終盤付近でGD 1 55信号が急速に増加することを確認してください。

その後、DACチャンネル設定タブに戻ります。「makeup, gas」までスクロールし、新しい同位体ピーク値を入力します。「set actual current value」をクリックします。

次に、「save」をもう一度クリックして、目的の同位体と酸化物の比率を記録します。まず、チューニング溶液を450 µL、2回目に注入します。次に、「parameter」タブのドロップダウンメニューから「time」を選択し、「start」ウィンドウに0、「end」ウィンドウに10、「step value」ウィンドウに1、「settling」ウィンドウに200を入力します。

masses per readingウィンドウの再生ボタンをクリックした後、カーソルを使用してTM 1 69またはTB 1 59の高い方の値、およびGD 1 55の値を読み取ります。次に、サンプルループを通してMilli Q水を3 mL注入し、続いてDVS洗浄液を500 µL注入します。mass calibrationタブでrunをクリックし、ストリークの強度が低下し始めるまで洗浄プロセスの進行をモニターします。

次に、3 mLのMilli-Q水で洗浄し、ストリークがバックグラウンドレベルに下がるまでモニターします。まず、先ほど実演したサンプル同位体をチューニング溶液の同位体として入力し、「保存」をクリックします。次に、データ収集ウィンドウを開き、サンプル量に応じてデータ収集設定を必要に応じて変更してください。

例えば、450 µLのサンプルでサンプルループを満たし、細胞データの取得に伴う遅延を考慮して、走行時間を600秒に設定します。走行前に、取得遅延を少なくとも30秒、検出器安定化遅延を少なくとも20秒に設定してください。細胞サンプルをmilli cube水で少なくとも2回洗浄し、その後、サンプルを最大10⁶ cells/mLで再懸濁させ、得られた細胞溶液を35 µmのセルストレーナーでろ過します。

凝集塊を除去します。次に、現在のサンプルに新しいファイル名を入力してください。すべてのファイルはEドライブに保存する必要があることに注意してください。

次に、サンプルループバルブをロード位置に切り替えてサンプルを注入し、サンプルループバルブを再び注入位置に戻してから、「Run」をクリックします。データ収集ウィンドウにおいて、細胞はスナップショットウィンドウ内で各垂直アイソトープチャネルにおけるマークの水平な集まりとして表示されます。ここで示されているように、秒間300〜500細胞付近で最高の分解能が得られます。

サンプルのデータ収集が完了すると、ポップアップウィンドウが表示されます。[OK]をクリックしてサンプルのラン完了を確認し、次に、サンプルのキャリーオーバーを最小限に抑えて装置を洗浄するため、各サンプルの間に少なくとも500 µLのMQ水（超純水）を注入してください。使用後は、サンプルループに450 µLの洗浄液を注入します。遊離金属の放出をモニタリングした後、バックグラウンドのストリークレベルに達するまで洗浄をモニタリングしながら、3 mLのMilli Q水でサンプルループをフラッシュしてください。

次に装置をシャットダウンするには、インストゥルメントセットアップウィンドウのRFGコントローラータブを選択し、「stop plasma」をクリックします。手順が完了すると、ポップアップウィンドウが表示されるので「okay」をクリックします。このとき、カードケージタブでネブライザーを取り外すことが推奨されます。ヒーターの電源を切り、アルゴン供給ラインのバルブを閉じてから、ネブライザーを慎重に後方に引き、スプレーチャンバーから取り外します。

次に、サンプル導入チューブのネジを緩めて取り外し、脇に置きます。メイクアップガス導入接続部のネジをわずかに緩めてから、ネブライザーを抜き取ります。最後に、先ほど使用したシリンジとチューブを用いて、ネブライザーの両方のポートを5% Citronで洗浄し、次回の使用まで5% Citronに浸した状態でネブライザーを保管します。

UE水およびDVS洗浄液を用いてマスサイトメーターを十分に洗浄することで、チューブや装置のその他の部品への金属吸収レベルが低減し、これらのグラフに示されるようなバックグラウンドの低減に寄与します。マゼンタ色の線で示される不適切なチューニングでは、濃い青色の線で示される適切にチューニングされたサンプルと比較して、m + 16における酸化物形成が著しく増加しています。これにより、mにおける目的の信号がわずかに減少し、m + 16における不要なバックグラウンド干渉が大幅に増加するという影響が生じます。

Milli Q水でサンプルを適切に洗浄および希釈することで、迅速性を維持しつつ、バックグラウンドを最小限に抑え、細胞の分解能を最大限に高めることができます。本実験で示している代表的な実験データと同様に、天然存在比のlanthanum 1 39 ODIUM one 40、TERBIUM 1 59、DIUM 1 69、およびLUTETIUM 1 75を含むポリスチレンビーズを細胞取得モードで解析しました。データはFlowJoを用いて解析し、破砕したビーズ由来のデブリはゲートアウトして除外しました。

適切にチューニングされたサンプルは、濃い青色の線で示される0.74 liters per minuteの流量であると決定されました。この流量では、より低い流量よりも高い信号強度が観察され、この適切にチューニングされたサンプルは、不適切にチューニングされた信号よりもM金属質量で高い信号を示し、m plus 16酸化物質量での信号が低いことが観察されました。ここでは、M Mass LANTHANUM 1 39およびTHULIUM 1 69における信号の拡大図を示します。

メイクアップガスの流量は、thulium 1 69 の信号強度よりも LANTHANUM 1 39 の信号強度に大きく影響することに注意してください。これらのグラフは、それぞれ LANTHANUM 1 39 + oh 16 および thulium 1 69 + oh 16 の酸化物に対応する、m + 16 の酸化物質量 1 55 および 180 5 における信号を示しています。lanthanum 1 39 は thulium 1 69 よりも酸化されやすいため、メイクアップガスの流量が増加すると、質量 180 5 の信号よりも質量 1 55 の信号が大幅に増加することに注意してください。

メイクアップガスの流量に対するmおよびm+16の信号強度がここに示されています。塗りつぶされたアイコンは質量Mを表し、白抜きのアイコンは質量M+16を表します。また、線の色はそれぞれの質量Mに対応しています。LANTHANUM 139およびPRASEODYMIUM 141の信号強度は、メイクアップガスの流量による影響を強く受けることに注意してください。場合によっては、質量Mよりも多くの質量m+16の酸化物が存在する点にまで達します。このビデオを視聴することで、CyTOFの適切な起動、チューニング、サンプルの測定、そして一日の測定終了後の適切な洗浄およびシャットダウンの手順について十分に理解できるはずです。