抗原特異的規制用のトランス生体内遅延型過敏アッセイ

本手順の全体的な目的は、trans vivo DTHアッセイを用いて、ヒト被験者における抗原特異的な前炎症性および抗炎症性の応答の両方をモニタリングすることです。まず、ヒト被験者の末梢血から末梢血単核細胞（PBMC）を分離します。次に、調製したPBMCをPBSと混合します。

リコール抗原テスト抗原およびテスト抗原にリコール抗原を加えたものを準備します。足底の事前測定を行い、調製した混合液をSKIDマウスに注射します。24時間後に足底の測定を繰り返します。3。

DTH反応の確定的なパターンには、調節性、非調節性、および感作性のものがあります。trans vivo遅延型過敏症アッセイは、移植ドナーの細胞が抗原源となる同種反応などの臨床パラメータを決定するために適用できます。既存のin vitro法に対するこの手法の主な利点は、単一のアッセイシステムを用いて、同種抗原、自己抗原、または腫瘍抗原に対する炎症促進性反応と調節性反応の両方を容易に検出できることです。

私の研究室の研究員であるEgonが、血小板の活性化を避けるため、酸性クエン酸デキストロース管に採取した新鮮なヒト末梢血を用いた手順を実演します。標準的な方法に従い、リンパ球分離媒体を用いてPBMCを単離します。PBSでPBMC調製液を洗浄し、混入した血小板を除去します。

赤血球の混入が顕著な場合は、CK溶血バッファーを用いて赤血球の溶血を行ってください。その後、PBS Resusでさらに2回洗浄します。アロ抗原用に、PBMCをPBSで1 mLあたり10 million PBMCの濃度で懸濁させてください。

先に示した手順を用いてドナーの末梢血から単離したP BMCsを用意します。次に、ドナー細胞をPBSで120 million cells/mLの濃度で懸濁し、タンパク質の分解を防ぐために1 µMのPMSFを加えます。

次に、2 mmプローブの超音波破砕機を用い、1秒間のパルスを7回照射して細胞懸濁液をソニケーションします。血球計数器を使用して、90%以上の細胞が破壊されていることを確認してください。

次に、混合物を 14,000 RPM、4 °C で 20 分間遠心分離します。上清を慎重にセーフロックチューブに移し、注入分ごとに標準法を用いてタンパク質濃度を測定します。10⁶ 個の PBMC を 2 mL ずつ、7 つ分に分注します。

セーフロックチューブを用い、遠心分離によって細胞をペレット化します。まず、35 µLのPBSでPBMCの陰性対照懸濁液を調製します。次に陽性対照として、リコール抗原である破傷風トキソイドおよびジフテリアトキソイドを25 µL加え、PBSで注入量を35 µLに調整します。

ドナー特異的反応を評価するための実験デザインに従い、細胞ペレットを10 µLのドナー抗原と25 µLのPBSに再懸濁し、合計容量を35 µLにします。実験的なドナー抗原特異的調節を評価する場合は、10 µLのドナー抗原と25 µLのリコールTT DT抗原を加え、細胞ペレットを35 µLに再懸濁します。イソフルランでマウスを麻酔させた後、スプリングロードキャリパーを足底の中央に配置し、計測部位を一定に保つための基準とするため、一方の端を足の最後方歩行パッドに接触させ、ゲージの読み値が安定するまで待ちます。

足底注射に備えて、足底のベースライン厚を記録します。針先を指の方に向け、針の切り口（ベベル）を上にした状態で注射器を配置します。次に、各細胞懸濁液のマウス後肢足底への皮下注射を開始します。

まず、右足底に陰性対照調製物をゆっくりと注射します。次に、左足底にPBMCとTT dtの陽性対照を注射します。その後、マウスをケージに戻します。

2番目に、右足底にPBMCとアロ抗原を、左足底にPBMC、アロ抗原、およびTT dtを注射します。注射後18〜24時間で漏出がないことを確認してください。各マウスをイソフルランで麻酔し、足底の腫脹の測定を繰り返します。

注入後の値から注入前の各足底部厚を差し引き、足底部の腫脹値を求めます。次に、処置群で得られた足底部腫脹値からコントロール群の足底部腫脹値を差し引いて、抗原特異的な正味の腫脹量を算出します。ポジティブコントロールにおいて、想起抗原TT DTに対する反応が25 × 10⁻⁴ inches以上であることを確認し、陽性と判定します。

テストが有効であると見なされるためには、PBSに対するバックグラウンド応答が必要です。次に、ドナー抗原存在下における想起応答の抑制を判定します。この実験では、腎移植レシピエントにおけるドナー抗原特異的応答および制御能を評価します。

移植レシピエントにおける遅延型過敏反応には、主にレギュラトリー（制御性）、ノンレギュラトリー（非制御性）、および感作型の3つのパターンがあります。すべての患者が、リコール抗原ttのポジティブコントロールに対して強い反応を示しました。患者番号62は、ドナー抗原に対する弱い反応と、ドナー抗原存在下でのリコール抗原反応に対する顕著な連関抑制を特徴とするレギュラトリーパターンを示しています。

これは臓器同種移植片の耐性と関連していることが判明したパターンです。患者番号48は非調節性パターンを示しており、ドナーに対する反応は弱いが、連関抑制は見られないという特徴があります。このパターンは、免疫抑制剤を投与されている患者に頻繁に観察されています。

患者8は、ドナー抗原に対して高い反応を示し、連動した抑制が見られないドナー感作パターンを呈しています。この反応は移植片拒絶に関連しています。臨床症例研究では、観察試験に登録された被験者のP BMCを用いて、ドナー特異的な間接経路、Tエフェクター、およびTレギュラトリーの反応を分析し、臨床的耐容におけるドナー特異的調節の役割を評価しました。

ドナー抗原に対する間接的なT細胞反応は、登録グループ間で明確なスペクトラムを示します。足底の腫脹は、患者の臨床状態が耐性状態から慢性拒絶状態へと移行するにつれて増加します。ここでは、連鎖抑制アッセイを用いて、ドナーに対する間接経路の制御性T細胞反応を測定します。

これらのデータは、最も耐性の高い患者から中間的な患者、そして最も耐性の低い慢性拒絶反応患者にかけて、制御反応が低下していることを示しています。総合すると、trans vivo DTHアッセイで測定された免疫制御は、腎同種移植片の受容における重要なメカニズムであると考えられます。

有望な領域の一つに、自己免疫のモニタリングへのTDTHアッセイの応用があります。細気管支炎閉塞性（OBL）症候群の病理学的プロセスにおけるV型コラーゲンの役割に関する我々の研究では、肺移植レシピエントから採取したPBMCに対するコラーゲンへの反応が陽性であった患者において、BOS発症の相対リスクが最も高いことが明らかになりました。一方、健常対照群やコラーゲンからは認められませんでした。

腎移植後の反応性good pasture症候群患者4名は、多くの場合コラーゲンVに対して反応性を示しました。TDTHアッセイは、がん患者由来のpbmcの腫瘍特異的抗原に対する反応性を試験するためにも使用できます。例えば、前立腺がん患者におけるPAP特異的T制御細胞の存在は、PAP抗原を用いたワクチン接種への反応を制限する可能性があります。

TRANSVAAL DTHアッセイは、移植患者、がん患者、および自己免疫疾患患者における細胞性免疫応答を評価するための臨床応用の可能な新しい診断テストです。このアッセイは、エフェクターT細胞の想起応答のモニタリングに有用であるだけでなく、エフェクターT細胞や調節性T細胞の検出を特定のサイトカイン測定に依存しないため、調節性T細胞応答の検出にも利用できるという価値があります。非常に柔軟であり、幅広い適用が可能です。