蛋白質のマイクロ アレイの試金抗原特異的抗体の応答次のクロストリジウム ・ ディフィシル感染症の血清学的定量

この方法は、クロストリジウム・ディフィシル感染症に対する臨床的に有用な免疫療法を患者特異的に最適化および選択し、クロストリジウム・ディフィシルに対するヒトの免疫応答を解明するのに役立つ可能性があります。この手法の主な利点は、C.difficile抗原に対するマルチアイソタイプおよび株特異的抗体応答を正確かつ同時に定量できることです。一般に、この方法に不慣れな個人は、高度に精製された抗原のパネルを確立して最適化し、技術プラットフォームを設定するための専門知識が必要なため、苦労するでしょう。

マイクロ波プレートの準備、アレイ印刷、安全な手順、およびデータ分析に関与する方法論的なリストタイプは細部に注意を払う必要があるため、この方法の視覚的なデモンストレーションは重要です。手順の一部をデモンストレーションするのは、私の研究室の技術者であるSam Greenwoodです。まず、クロストリジウム・ディフィシル抗原とプリンティングバッファーを最適な濃度に希釈します。

次に、10マイクロリットルの抗原溶液を384ウェルプレートに移します。プレートをプレートシールで覆い、室温で5分間、重力300倍で遠心分離します。マイクロアレイ印刷の場合は、ハンドヘルドガスバーナーを使用して、シリコンPINを3回、それぞれ2秒間加熱します。

次に、シリコンPINをきれいな水で3回、それぞれ3秒間すすぎます。マイクロアレイプレートをアレイアーのローディングカートリッジに入れます。トレイを取り出し、アミノシランスライドをスライドトレイに置き、OKボタンを押して真空をオンにします。

すべてのスライドが固定されていることを確認し、[OK] をクリックします。トレイを元の位置に戻して、蓋を閉めます。次に、適切なプログラムを起動し、[ファイル]、[マイクロアレイパラメータ]、[開く]の順に移動します。クロストリジウム・ディフィシル・ファイルを選択して、すべての抗原を四重体で印刷します。

このウィンドウで、サンプルストレージを示すための「ソース」タブとマイクロアレイの詳細を入力するための「ターゲット」タブを開きます。次に、[オプション]タブを開いて、洗濯ツールを選択します。「実行設定」の「一般」タブにある TAS アプリケーション・スイートのツールバーで、「実行開始時に洗浄」を選択し、「実行終了時に洗浄」を選択します。

[気候]タブを開き、湿度レベルを55〜60%に設定します今すぐ実行を開始し、アレイャーを定期的にチェックして、適切に機能していることを確認します。印刷後、印刷したスライドを16個のマルチウェルチャンバーを備えたスライドホルダーに慎重に置きます。次に、各ブロックに100マイクロリットルの5%BSATを追加します。

スライドを覆い、振とうしながら室温で1時間インキュベートします。120マイクロリットルのPBSTを使用して、各ブロックを振とうしながら各ブロックを1分間5回洗浄します。次に、Cディフィシル感染患者と健常対照者から採取した血清サンプルを氷上で20分間解凍します。

マスターブロックに市販の抗体希釈液を添加し、マスターブロックにサンプルを添加して混合します。洗浄バッファーを廃棄し、希釈した各サンプルを100マイクロリットルを実験ブロックに加えます。ネガティブコントロールブロックには、抗体希釈液のみを100マイクロリットル追加します。

次に、スライドを室温で1時間、穏やかに振とうしながらインキュベートします。次に、120マイクロリットルのPBSTを使用して、各ブロックを振とうしながら各ブロックを3分間5回洗浄します。次に、抗体希釈液で希釈したビオチン化ヤギ抗ヒト抗体100マイクロリットルを各ブロックに加えます。

スライドを覆い、室温で1時間、穏やかに振とうしながらインキュベートします。120マイクロリットルのPBSTを使用して、各ブロックを振とうしながら各ブロックを3分間5回洗浄します。次に、5%BSATで希釈したストレプトアビジンSY5コンジュゲート100マイクロリットルを、各ブロックに1〜2000の比率で加えます。

スライドをホイルで覆い、室温で15分間静かに振とうしながらインキュベートします。スライドを最初に120マイクロリットルのPBSTで1分間ずつ5回洗浄し、次にPBSでさらに2回、1分間ずつ洗浄します。スライドを乾燥させるには、重力の300倍で5分間回転させます。

スキャンの30分前にレーザースキャナーの電源を入れて、ウォームアップします。次に、プレートライトが緑色に点灯するまで、印刷面を上に向けてスライドをスキャナーに置きます。次に、設定ボタンを押します。

最初のタブで、自動スクロールとバーコードがオフになっていることを確認します。次に、ピクセルサイズを10に、スキャンモードを中、取り込みを635のみ、取り込みモードを手動に、ゲインを20に、電力をローに設定します。2 番目のタブで、スライドの種類にラベルが付いていないことを確認します。

3 番目のタブで、[フォーカス] 設定を [オート フォーカス] に設定します。インポートグリッドボタンを押して、スキャンした画像に関連付けられた適切な配列リストを選択します。次に、自動検索ボタンを押して、グリッドをスライド上のスポットに揃えます。

最後に、Quantification Processボタンを押して、各スポットの蛍光強度を測定します。次に、結果を適切な形式で保存して、さらに分析します。このプロトコルでは、タンパク質マイクロアレイをELISAと比較し、これら2つの技術間の再現性を評価します。

Spearman相関係数解析では、血清サンプル中のIgG抗毒素Aおよび抗毒素Bレベルを検出するためのマイクロアレイとELISAとの間に有意な一致が示されました。タンパク質マイクロアレイのイントロアッセイおよびインターアッセイの再現性は、7人の患者の血清サンプルを使用して計算されます。毒素A、毒素B、SLP001、SLP002、SLP027、毒素B、毒素BからCCUG株のみを産生する毒素、およびpCDTb抗原に対して2つの異なるアレイスライドで分析したサンプルは、良好な再現性を示しています。

タンパク質マイクロアレイは、クロストリジウム・ディフィシル毒素に対するアイソタイプ特異的抗体応答を検出するために行われます。患者および健康な個人の血清サンプルは、毒素A、毒素B、クロストリジウム・ディフィシル毒素Bからの毒素Bに対するIgGおよびIgAのレベルを検出するために使用されます。一度習得すれば、このテクニックは7時間で完了します。

品質管理実験では、適切な表面化学の選択、プリンティングバッファー、ブロッキングバッファー、血清サンプルと二次抗体の希釈などのさまざまなパラメーターをサンプルを泳動する前に評価する必要があります。高品質のアレイをプリントするには、アレイを十分に理解しているか、実験プロトコルに従ってパラメータのプリントを調整するためのソフトウェアが必要です。アレイアーの最適な性能を維持し、実験全体を通じて粉塵のない環境を維持することが非常に重要です。

この技術は、感染に対する体液性免疫応答の特性評価や血清診断抗原の発見という点で、免疫学および分子生物学の分野の研究者に道を開くことになります。感染した血液サンプルや細菌毒素を扱う作業は危険な場合があることを忘れないでください。一般に、実験室では、この手順を実行する際には、安全性と標準的な予防措置を常に考慮する必要があります。