C57BL / 6マウスにおける妊娠中のアルコール誘発性アポトーシスに対する神経栄養ペプチドの効果をテストするための実験方法、ADNF-9、

この手順の目的は、胎児のアルコール曝露モデルにおける栄養ペプチドの神経保護効果を評価することです。これは、最初に実験動物を交配させ、次に妊娠した女性を栄養ペプチドで治療することによって達成されます 第2ステップとして、胎児を解剖して胎児の脳を分離します 実験的使用のために。次に、胎児の脳をゼラチンに埋め込んで切片化し、続いてトンネル染色を行って細胞死の結果を決定しました。

これは、出生前のアルコール曝露が神経節隆起のトンネル陽性細胞の数を増加させることを示しています。栄養ペプチドの対照群投与と比較して、A DおよびF nineは、対照アルコール処理動物と比較して、トンネル陽性細胞におけるアルコール誘発増加を有意に減少させた。胎児の脳は非常に小さいため、胎児の脳は非常に小さく、最初の品種C 57ブラック6マウスを解剖し、約20グラムの生後6週齢の雌マウスを除去直後に2時間男性の家庭用ケージに入れることにより、胎児の脳の解剖と埋め込みステップを学ぶのが難しいため、この金属の視覚的なデモンストレーションは重要です。

各メスに精子プラグがあるかどうか確認し、交配が行われたことを確認します。精子プラグが存在する場合は、この胚の日をEの7つの体重一致の妊婦に4つのグループに指定します。1つのアルコール流動食グループは、唯一の栄養素源として無料でアクセスできました。

2 Perfed 対照群 3 ペプチド治療群で、アルコール曝露と並行して DNF 9 ペプチドの腹腔内注射を受ける必要があります。流動食。30ミリリットルの目盛り付きスクリューキャップチューブから24時間以内に動物が消費した流動食の量を記録し、唯一の栄養素源として無料の過剰分を介して提供できるアルコール、流動食、またはペアの流動食の1日の量を決定します。

妊娠中のマイヤーE 13を二酸化炭素安楽死によって犠牲にした後、E 7からE 13まで毎日作りたての流動食が提供され、その後に子宮頸部脱臼が続くことを確認してください。死体を解剖ボードの上に仰臥位で置き、70%エタノールで腹部を洗浄します。滅菌ハサミと鉗子を使用して腹部を切開します。

腹部が開いたら、鉗子で子宮を保持し、2番目の鉗子を使用して、胚に穴を開けることなく、子宮内膜を子宮からゆっくりと穏やかに引き裂きます。子宮から胚を慎重に取り出し、ハンクのバランスソート溶液に移します 濡れた氷の上の60ミリメートル×15ミリリットルの細胞培養皿で、超微細鉗子を使用して実体顕微鏡のステージに皿と氷容器を置きます。頭頂部の胚の皮膚を引き剥がして、頭蓋骨を露出させます。

頭蓋骨が露出し、実体顕微鏡ではっきりと視覚化されたら、鉗子で脊髄と脳幹のレベルで頭蓋骨の基部をつかみ、頭蓋骨の剥がし始めます。頭蓋骨を頭の後部から前部にかけて一つずつ剥がし続けます。脳が完全に露出したら、鉗子を使用して脳を抽出します。

次に、原始球根または工場球根の基部からメットポストフィックスの基部まで胎児の脳を解剖し、4%パラアルデヒドですべての胎児の脳を2〜3日間解剖します。胎児の脳は、ウェスタンブロットまたは酵素アッセイで試験する場合にも凍結することができます。蒸留水で調製したグレードAゼラチンの10%溶液を調製した後、包埋型を皮をむいて半分まで満たし、ゼラチンが固まるまで待ちます。

固化したゼラチンの上にコントロールと出生前に治療された胎児の脳を並べて置きます。これは、対照群と実験群の両方で一貫した条件を維持するためです。ゼラチンが熱すぎないことを確認し、胎児の脳の上に液体ゼラチンを追加して完全な型を作ります。

最終的な型はこの画像のようになるはずで、胎児の脳を保持する準備したゼラチン型を15分間冷蔵します。次に、埋め込み型枠のプラスチックをはがします。最終的な型はこのようになり、胎児の脳を含むゼラチンを4%パラアルデヒドに2日間移します。

3日目に、固定された胎児の脳を含むゼラチンブロックを卵管のステージに取り付けます。次に、冠状切片化のために25〜50ミクロンの厚さに設定されたバイオームを使用して脳を切片化します。胎児の脳切片をPBSに集めてから、胎児の脳切片をスーパーフロストとスライドに取り付けて水に浸し、15分間乾燥させます。

15分経過後。スライドをPBSに入れて、トンネル反応の翌日試験を行います。まず、スライドを20マイクログラム/ミリリットルのプロテイナーゼKとPBSの溶液に摂氏37度で5分間浸します。

次に、オービタルシェーカーでPBSで3回、それぞれ5分間すすぎます。切片をメタノール中の3%過酸化水素と共に室温で10分間振とうせずにインキュベートします。次に、以前と同じようにスライドを洗います。

次に、切片を透過性溶液中で氷上で2分間インキュベートします。インキュベーション後、PBSで2回洗浄した。前回と同様に、実験用ティッシュを使用して、切片の周りのスライドの領域を乾燥させます。

次に、パットペンを使用して、スライド上のセクションの周りを描きます。これにより、染色液の漏れを防ぎ、少量で使用することができます。各ペアの1つのセクションを、製造元の指示に従って調製したトンネル反応混合物とインキュベートします。

トンネル試薬を含まないキャリア溶液をネガティブコントロールセクションに追加します。次に、スライドを摂氏37度で1時間インキュベートします。インキュベーション時間が経過したら、前回と同様にオービタルシェーカーでスライドをPBSで3回洗浄します。

次に、実験用ワイプで組織の周囲を乾かします。次に、切片をコンバーターPOD溶液で37°Cで30分間振とうせずにインキュベートします。次に、切片をトリスHCLでそれぞれ5分間3回すすぎます。

スライドをホルダーに移し、0.05%DABと0.003%の過酸化水素が入ったコプリンジャーに入れます。瓶をアルミホイルで覆い、インキュベーション後7分間氷上のオービタルシェーカーに置き、必要に応じてPBSを洗浄します。スライドは、プロトコルのテキスト部分に詳述されているように、ミサイルカウンター染色に進む前にPBSに保存することができます。

次の図は、神経栄養ペプチド、A DNF 9のアルコール誘発性アポトーシスに対するアルコール誘発性アポトーシスに対するアルコール誘発性アポトーシスに対する効果を示しています。これは、E 13段階の出生前アルコール曝露がPF群と比較してA LC群の矢印で示されているように、神経節隆起におけるトンネルアッセイです。出生前のアルコール曝露と並行してA D NF nineを投与すると、トンネル陽性細胞の減少が誘発されました。統計解析により、ADおよびFナインの投与により、アルコール誘発性トンネル陽性細胞の増加が防止されることが示されました。

値は、平均の平均に標準誤差をプラスした値として表示されます。1 つのアスタリスクは、P 値が 0.052 未満であることを示します。アスタリスクは、Newman Colesの事後検定によるP値が0.01未満であることを示します。

各グループには 4 の N が含まれていました。したがって、その開発後、この技術は、研究者や脳の発達の分野がマウスの薬物や化合物と脳の発達の影響を調査するための方法です。