競争力のあるマウス骨髄移植モデルにおけるドナー細胞の生着を​​決定するために、定量的リアルタイムPCRを用いて

この手順の全体的な目標は、競合するマウス骨髄移植モデルでドナー細胞の生着を定量化するPCRベースの技術を実行することであり、これは最初に雄のドナー細胞を使用して雌のレシピエントマウスで骨髄移植を行うことによって達成されます。次に、異なる時点でレシピエントマウスから末梢血を採取し、ゲノムDNAを単離します。サンプルは標準曲線用に調製されます。

最後に、標準サンプルとテストサンプルを使用してリアルタイムPCRを実行します。最終的には、オス対メスのDNAの割合がわかっている標準曲線に対する計算を通じて、メスのレシピエントマウスにおけるオスのドナー由来細胞の生着を示す結果を得ることができます。この手法は、フローサイトメトリーベースの方法のような既存の方法よりも優れている点は、感度が高く、経済的で、サンプルを長期間保存できることです。

最も重要なことは、私たちの技術は最も文字列に依存せず、レシピエント細胞からドナー細胞を区別するために明確に定義された細胞表面マーカーのようなマウスの任意のゲノム背景に使用することができる FVB njを安楽死させた後、層流フードの下の雄ドナーと雌マウスは、小さなハサミと鉗子を使用して大腿骨と脛骨を解剖し、6ミリリットルの氷冷を含む60ミリメートルの組織培養皿にそれらを置きますRPMI 1640 は 5% の熱で不活性化されています。FBSは、キムワイプを使用して筋肉やその他の組織を取り除き、皿の各骨シャフトの両端を切り取ります。次に、骨の端を、5%の熱不活化FBSで満たされたRPMI 1640で満たされた3ccの注射器に取り付けられた23ゲージの針に接続し、骨髄を洗い流します。

同じ針を使用して、繰り返し吸引することにより骨髄組織を解凝集します。細胞懸濁液を15ミリリットルの遠心分離管に移し、400 G.Afterで5分間スピンダウンし、スーパーナトを除去した後、室温、赤血球溶解、緩衝液の1ミリリットルで細胞を再懸濁し、室温で5分間インキュベートしてから、5%熱不活化FBSとRPMI 1640の5〜10ミリリットルを追加する前に、細胞を細胞ストレーナーに通し、新しい管。400 Gで5分間細胞をスピンダウンし、上清を除去した後、ペレットは、穏やかにボルテックスした後、5%の熱不活性化FBSで10ミリリットルのRPMI 1640に再懸濁された赤血球の完全な除去を示す赤色が存在しない必要があります、ヘモサイトメーターに小さなアリコートを追加し、細胞を数えます。

骨髄移植のために、競合他社の女性細胞と5対2の比率で混合するために必要な細胞の量を計算します。注射用の細胞を準備するための最終ステップとして、ドナー細胞と競合細胞を混合し、PBSで洗浄した細胞をペレット化し、骨髄移植の4〜6時間前に、ドナー細胞1ミリリットルあたり10〜6倍、競合細胞1ミリリットルあたり10〜6倍の最終濃度でPBSに再懸濁します。レシピエントマウスの雌にセシウム1 37ガンマ線を11グレイの単回線量で照射します。

照射した雌マウスをマウス拘束具に置き、各マウスが第5のドナー細胞に10を5倍、第5の競争相手の骨髄細胞に10を2倍受けるように、合計0.1ミリリットルの尾静脈を介して混合ドナー細胞と競合細胞を注入して血液サンプルを採取する。麻酔後、マウスは眼窩後出血により約50マイクロリットルの血液をEDTAコーティングチューブに集めます。また、年齢が一致した雄と雌のマウスからサンプルを採取します。

次に、対象マウスおよびマウスからゲノムDNAを単離する。標準曲線として、約200マイクロリットルの室温RBC溶解バッファーを各血液サンプルに加え、5分間インキュベートします。PBSを1ミリリットル加え、スピンダウンして溶解したRBCのほとんどを除去します。

次に、血液DNA抽出キットを使用してDNAを分離し、elucianバッファーを摂氏37度に温めます。収量を増やすには、各サンプルのDNA濃度を測定します。ODが2、60対2、80の比率が1.8から2.0のものが、さらなる分析に使用されます。

標準曲線を設定するには、オスとメスのDNAをマイクロリットルあたり4ナノグラムの濃度に希釈し、これらのガイドラインに従ってDNA混合物を調製します。Cyber Green Super Mix試薬とここに示すプライマーおよびゲノムDNAを混合して、PCR反応プレートをセットします。各20マイクロリットルの反応には、各プライマーの400ナノモルと、3重に実行される5マイクロリットルの血液細胞ゲノムDNAが含まれています。

テキストプロトコルに記載されている条件に従ってPCRを実施し、サイクル閾値またはCT値を取得します。デルタCTに量CTをZYの1乗からCTを引いたBCLの2乗とZYの1の発現レベルまたは2をマイナスデルタCTの累乗に計算し、三重化2の平均をデルタCT値の累乗にプロットすることにより、標準曲線を生成します。これは、男性DNAの割合に対するデルタCTの累乗に対する平均値2でプロットされた標準曲線の例です。

このプロットには、BCL 2 アンプと ZFY 1 アンプリコンの比融解温度が含まれており、それぞれ 78.5 °C と 88.5 °C に局在しています。BCL 2は、各PCR反応でロードされたDNAの総量を正常化するための参照遺伝子として使用されます。BCLは、各標準サンプルの2つの増幅曲線がオスDNA濃度に関係なく互いに合流し、ロードされたDNAの量が等しいことを示しています。

しかし、PIM TKOマウスの造血幹細胞は、サンプル中の雄DNA量の増加に伴って左に移動したZFY one増幅曲線は、致死放射線照射マウスの再構成に欠陥があり、予想通り、PIM TKO細胞を移植したレシピエントマウスは、野生型細胞を移植したマウスと比較して雄細胞の割合がはるかに低かった。私たちの方法を検証するために、移植された雌マウスの雄ドナー細胞の生着をテストし、移植後の異なる時点で野生型マウスとPIMトリプルノックアウトまたはTKOマウスの骨髄細胞を受け取りました。6週間で末梢血、16週間で骨髄サンプルの両方を受け取りました。このビデオを見て分析しました。

PCRベースの方法を使用して、競争力のある海洋骨髄移植モデルでドナー細胞の生着を定量化する方法について十分に理解している必要があります。