ハイスループットマイクロプレートアッセイを用いてウォーターズ、土壌、および底質中の微生物細胞外酵素活性の測定

次の手順の全体的な目標は、さまざまな自然環境における微生物の細胞外酵素活性を迅速にアッセイすることです。これは、水または土壌スラリーのサンプルをマイクロプレートに添加して適切な複製を行うことによって達成されます 第2ステップとして、人工着色または蛍光測定基質がマイクロプレートウェルに追加され、酵素反応が起こることを可能にします。次に、反応中に放出される最終生成物の量を決定するために、吸光度または蛍光のいずれかを測定します。

その結果、最終反応の吸光度または蛍光に基づくサンプル間の細胞外酵素活性の違いが示されました。今日は、自然環境における細胞外酵素活性の測定方法をご紹介します。この方法は、有機物処理の水速度や土壌、堆積物、水の栄養無機化など、微生物生態学における重要な質問に答えるのに役立ちます一般的に、この方法を使用するのが初めての個人は、特に多数のサンプルをアッセイするときに、反応溶液から粒子を分離するのが難しいため、苦労します。

プレートのレイアウトは習得が難しく、複数の時間ステップで測定を行うとこの手順がより困難になる可能性があるため、この手順を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。土壌および堆積物の細胞外酵素活性のコレメトリック分析は、土壌のテキストプロトコルに記載されているように、基質緩衝液および標準溶液の調製から始まり、滅菌済みの15ミリリットル遠心分離管でアッセイする各サンプルのスラリーを調製します。沈殿物用の50ミリモルアセテート緩衝液を使用して、1ミリリットルあたり約1グラムの濃度を追加します。

スラリーが簡単に配管できるように、十分なアセテートバッファーを追加します。必要なスラリーの正確な量は、アッセイする酵素の数によって異なりますが、最低5ミリリットルが推奨されます。土壌や堆積物のすべての塊が分散するまで、各スラリーを渦巻きにします。

そして、最終的なボリュームに注意してください。ピペットを打つ前に、ピペットの先端をハサミでクリップします。土壌スラリーは先端を詰まらせる傾向があるため、各スラリーを再ボルテックスし、すぐに150マイクロリットルを6つのウェルのそれぞれにピペットで入れます。

96ウェルディープウェルブロック上。徹底的かつ頻繁にボルテックスすることが重要です。土壌粒子を懸濁状態に保つには、ブロックごとに少なくとも2つのウェルを空にして、基質制御として機能します。

1 96を準備します。アッセイする各酵素のウェルブロック。約5ミリリットルのアセテートバッファーをピペットリザーバーに注ぎ、8チャンネルピペットを使用して、各サンプルの最後の2つのウェルに150マイクロリットルのバッファーを追加します。

サンプルバッファーコントロール用と2つの基質コントロールウェル用。約10ミリリットルの適切なpニトロフェンネルまたはPNP基質溶液をピペットリザーバーに注ぎ、8チャンネルピペッターを使用して、各サンプルの最初の4つのウェルと2つの基質制御ウェルに150マイクロリットルの基質溶液を追加します。基質溶液が添加されるとすぐに、反応が始まる時間に注意してください。

プレートを室温で0.5〜4時間インキュベートします。正確なインキュベーション時間は、サンプル中の活性レベルとアッセイする酵素によって異なります。アッセイのインキュベーション中に、透明な96ウェルマイクロプレートを1枚調製します。

吸光度ピペットを読み取るために、各ディープウェルブロックについて、190マイクロリットルの蒸留水と10マイクロリットルの1モルの水酸化ナトリウムをマイクロプレートの各ウェルに取り込む。水酸化ナトリウムは酵素反応を遅らせ、pHを上昇させ、インキュベーション後の反応中に放出されるPNPの色を強化します。96ウェルブロックを2000〜5、000倍Gで5分間遠心分離し、土壌粒子をペレット化します。

ペレットを乱さずに液体を除去することは困難な場合があります。最初は土壌サンプルを過剰に使用することは避けなければなりません。十分に長く遠心分離し、慎重でありながら自信を持って液体を引き出してください。

マルチチャンネルピペットを使用して、それぞれから100マイクロリットルを引き出します。ペレットを避けるように注意してください。調製された透明な96ウェルマイクロプレート上の対応するウェルに液体を移し、マイクロプレートリーダーをオンにし、必要なソフトウェアレコード吸光度を410ナノメートルで設定します テキストプロトコルに記載されているようにサンプルの乾燥質量を決定した後、サンプルアッセイの吸光度からサンプル制御吸光度を差し引いて各サンプルの最終吸光度を計算します。

基板コントロールの吸光度が0.060を超える場合は、それらを減算します。また、この式を使用して、乾燥質量1グラム当たりの1時間当たりの酵素活性をマイクロモルで計算します。テキストプロトコルに示されている例に従って、各酵素の黒いマイクロプレートを整理した後、最初の水サンプルの約5ミリリットルをピペットリザーバーに注ぎ、8チャンネルピペッターを使用して200マイクロリットルをすべてのウェルにピペットで移します。

マイクロプレートの列1では、使用済みのピペットチップを廃棄し、必要に応じて各水サンプルを繰り返して列1から9に充填します。サンプル、スタンダード、基質、クエンチングを考慮したコントロールを、サンプルと同じ黒色のマイクロプレートで設定します。サンプルコントロールにはサンプル水と重炭酸塩バッファーが含まれており、活性計算には使用されませんが、実験の過程を通じて読み取りの一貫性が実証されます。

クエンチコントロールは、サンプル水と標準量の蛍光タグで構成され、蛍光の回折を測定するために使用されます。サンプル中の水では、基質と標準コントロールは、それぞれ結合基質または標準蛍光タグと重炭酸塩バッファーのいずれかで構成されています。約5ミリリットルの5ミリモルの重炭酸緩衝液を清潔なピペットリザーバーに注ぎます。

50マイクロリットルのバッファーをd列とe列のマイクロプレートウェル1〜9にピペットで入れて2つを形成し、サンプル交換ピペットチップごとにサンプルコントロールのウェルを複製し、次に200マイクロリットルの重炭酸バッファーを列AとHのウェル10〜12に移します。 蛍光灯は光に敏感であるため、照明を暗くするか消灯して、周囲の照明を減らす必要があります。10マイクロモル、4メチルモネまたはMUBの約5ミリリットルをきれいなピペットリザーバーに注ぎ、マイクロプレートウェル1から12に50マイクロリットルをピペットで注ぎます。マイクロプレートを暗所に置くか、不透明な蓋で覆ってMUBの光による劣化を減らし、蛍光計の電源を入れ、必要なソフトウェアをセットアップして、基質を追加する前に読み取り可能な

適切なMUBライニング基質の約5ミリリットルを清潔なピペットリザーバーに入れるには、12チャンネルピペッターを使用して50マイクロリットルを列Aのマイクロプレートウェル1〜12にピペットで、列BおよびCのウェル1〜9にピペットで3つを形成し、各サンプルおよび3つの基質コントロールの反復アッセイを直ちに蛍光記録に進みます。読み取り後、マイクロプレートに基板を添加した直後の初期蛍光を読み取ります。蛍光法は、マイクロプレートを室温で暗所でインキュベートするか、または不透明な蓋で覆います。

MUBの光劣化を抑えたい。最大潜在的酵素活性を測定するために必要なインキュベーション時間は、サンプル内の酵素濃度によって異なります。これは不明なため、サンプルをアッセイする前に、マイクロプレートを複数回のステップで読み取る必要があります。

ほとんどの酵素では、1時間の間に10〜15分間隔が適切ですが、高濃度のサンプルの中には10分前にピークに達するものもあります。指定された間隔でマイクロプレート内の蛍光を少なくとも1時間読み続けます。読み取りの合間にマイクロプレートを覆うか、暗闇に置いてください。

各時間間隔の各サンプルについて、各時間間隔の平均初期サンプル蛍光、平均最終サンプル蛍光、平均標準蛍光、および平均クエンチ制御蛍光を計算します。酵素活性をm/時間/ミリリットルで計算します。テキストプロトコルにある方程式を使用します。

各時間ステップで計算されたアクティビティ値を調べ、アクティビティが最も高い時間ステップから最終的な潜在的なアクティビティを決定します。アクティビティ値が増え続ける場合は、後の時間ステップが必要になることがあります。実行の過程でアクティビティ値が減少した場合は、より短い時間ステップで再度実行します。

土壌や水生堆積物は、粒子の表面に付着した微生物群集が成長する結果として、通常、細胞外の酵素活性がかなり高いレベルにあります。この図は、ミシシッピ州北部の3次河川の表層堆積物から得られる粒子のサイズによって、この活動がどのように変化するかを示しています。USAAの以前の研究では、このストリームからの堆積物粒子上の細菌群集は、その群集構造の分子分析に基づいて3つの異なるグループに分離できることが示されています。

0.063 mm粒子、0.1 2 5 mm、0 0.25、0.5 mm粒子、1 mm粒子細胞外酵素活性のパターンの解析は、ホスファターゼが0.1 2 5、0 0.25、および0.5ミリメートルの粒子で類似しているが、PNPリンク基質技術を使用して測定した場合、1および0.063ミリメートルのフラクションではるかに高いことから、この結論を支持しています。βグルッコやn AGAなどの他の酵素は、最も細かい粒子で同様のピークを示しますが、1ミリメートルの粒子では上昇しません。

異なる酵素が異なる環境分布を示す可能性があり、これらはこのアッセイを使用して解明できるという事実を強調しています。比較的低いエラーバーは、堆積物上の酵素活性のコレメトリックアッセイが再現性があり、したがって統計分析に適していることを示しています。異なるサンプルと環境サンプルを比較すると、天然水は、土壌や堆積物がグラムあたりよりもミリリットルあたりの細胞外酵素活性が低い傾向があります。

そのため、MUB結合基質を使用して植物相を計量的にアッセイする必要があります。この図は、酵素、ホスファターゼ、ベータ、グルッコ、およびNGAの活性が深さによってどのように変化するかを示しています。アメリカ・ミシシッピ州北部の浅い湖では、栄養分が少ないことが知られていますが、これは微生物が有機化合物からリン酸塩を獲得するために作り出すホスファターゼや酵素の活性が比較的高いことも示唆しています。

3つの酵素すべてについて、水面と深さ50cmで採取したアッセイサンプルは同様の活性を示しました。100センチメートルのサンプルでは活性が上昇しましたが、サンプルは基本的に水の堆積物界面から採取されており、サンプル中の堆積物粒子の存在は、特にベータグルッコとnAGAsでサンプルに見られる高い活性を説明している可能性があります。PNP基質と同様に、誤差バーが少ないことから、わずか3回の反復読み取りでも、MUB基質を使用した蛍光測定法の再現性が高いことが示されています。

水サンプルの酵素活性の単位は消費された基質の単位であるのに対し、沈殿物粒子の酵素活性の単位は、単位あたりのサイズが同等であっても消費された基質のマイクロモル単位であることに注意してください。これは、土壌や堆積物が天然水よりもはるかに高い細胞外活動を持つ傾向があるという事実を浮き彫りにしています。また、MUBリンク基質技術の感度が向上し、この技術を水サンプルの細胞外酵素活性のアッセイに使用する必要性も示しています。

この技術は、土壌や堆積物に対してこの手順を試みながら、わずか1時間強で9つの水サンプルを酵素までアッセイするために使用できます。乾燥重量ベースで活動を表現できるように、既知の質量材料を使用することが重要です。このビデオを見れば、カラーメトリックまたは低メトリックの手法を使用して、細胞外酵素活性とさまざまな自然環境を測定する方法について十分に理解できるはずです。