遺伝子発現のDNA相互作用、ディスカバー転写レギュレータ、および新規抗腫瘍剤を同定：タンパク質を研究するために、定量的アッセイ
2013年8月31日
我々は、DNAと転写因子との相互作用を測定するための定量的なDNA結合性、ELISAベースのアッセイを開発した。 RUNX2タンパク質に対して高い特異性は、コンセンサスDNA認識オリゴヌクレオチドと特異的モノクローナル抗体を用いて達成された。酵素結合抗体基質反応と比色検出をリアルタイムでモニターした。
この手順の全体的な目標は、タンパク質DNA相互作用の調査、遺伝子発現の転写調節因子の発見、および新規抗腫瘍剤の同定に役立つ定量的DNA結合アッセイを実証することです。これは、まず、適切なビオチン化DNAターゲットを持つストレプトアビジンコーティングアッセイプレートを調製することによって達成されます。第2のステップは、潜在的な阻害剤の有無にかかわらず核抽出タンパク質を添加し、それらをDNAターゲットと結合させることです。
次に、結合した転写因子を一次抗体と西洋ワサビペルオキシダーゼ共役二次抗体で検出します。最後のステップは、発色を引き出すために、ウマダイサビペルオキシダーゼ基質をウェルに添加することです。最終的に、発色は分光光度計で測定されます。
時間の経過とともに、色の変化の量は、DNA結合の程度とDNA結合の潜在的な阻害剤の影響を示します。この技術が電気泳動移動度シフトアッセイなどの他の技術よりも優れている主な利点は、定量的なDNA阻害剤結合アッセイであることです。まず、試験する各条件について、少なくとも10〜7個の細胞の3倍からなる適切な数の細胞培養物を調製します。
ここでは、run X twoタンパク質を発現するヒト骨髄内皮細胞が使用されています。セルが80%コンフルエントになったら。G、2 M細胞周期境界での細胞増殖を阻止するコナゾールなし、ミリリットルあたり0.2マイクログラムで細胞を処理します。
これにより、run X two タンパク質が安定化し、16 時間後に最大の DNA 結合が生成されます。細胞を溶解し、添付のテキストプロトコルの指示に従ってタンパク質を単離します。タンパク質が単離されたら、標準的なBCAアッセイを使用してタンパク質濃度を測定します。
次に、サンプルを摂氏マイナス80度で、10マイクロリットルのアリコートに1ミリグラム/ミリリットルあたり2〜5ミリグラムの濃度で保存します。96ウェルプレートを炭酸ナトリウムの0.1モル溶液で固定し、300マイクロリットルの混合物を加えます。よく各サンプルが三重に実行されるように十分に準備します。
プレートを室温のロッキングプラットホームで2時間インキュベートします。次に、プレートを300マイクロリットルの連鎖球菌酸溶出剤で3回洗浄し、バッファーを洗浄し、100マイクロリットルのビオチン標識二本鎖オリゴヌクレオチドと1ウェルあたり1.25ナノモルで2時間、揺さぶりながらインキュベートします。次に、溶連菌性Din洗浄バッファーでプレートをさらに3回洗浄します。
次いで、1ウェルあたり3〜9マイクログラムのXDNA結合バッファーDNA結合タンパク質およびウェルあたり1マイクログラムのポリDIGCを含むマスターミックスのウェルあたり100マイクロリットルを添加する。次に、ビタミンD 3などの潜在的な阻害剤を含むマスターミックス、またはエタノールなどの溶媒コントロールの適切な希釈をそれぞれのウェルに加えます。次に、プレートを覆い、核抽出物とのインキュベーション後、一晩で摂氏4度のロッキングプラットフォームに置きます。
連鎖球菌と洗浄バッファーでプレートを3回洗浄します。次に、0.2ナノグラム/マイクロリットルに希釈したラン×2の特異的モノクローナル抗体と連鎖球菌アビッドおよび洗浄バッファーのウェルあたり90マイクロリットルを追加します。プレートを覆い、ロッキングプラットフォーム上で室温で1時間インキュベートします。
次に、ウェルを連鎖球菌と洗浄バッファーで再度すすぎ、溶連菌で希釈した5ナノグラム/マイクロリットルのファブ特異的アフィニティー精製HRP標識抗体を含む二次抗体混合物のウェルあたり90マイクロリットルを追加します。AVIDおよび洗浄バッファー。二次抗体をロッキングプラットフォーム上で室温で30分間インキュベートします。
次に、Strpのウェルあたり300マイクロリットルで6回洗浄し、バッファーを洗浄します。次に、サンプルの連続モニタリングのために、ストックボトルから直接各ウェルに50マイクロリットルのテトラエチルベナジン基質を添加することにより、結果を出します。サンプルを分光光度計に入れ、635ナノメートルの吸光度を連続的に測定します。
1回限りの測定の場合は、サンプルを室温で10〜20分間、暗所でインキュベートします。この間、井戸は透明からさまざまな程度の青に変わります。それぞれに50マイクロリットルの硫酸を加えて反応を停止します。
次に、96ウェルプレートリーダーを使用して、各ウェルの吸光度を450ナノメートルで測定します。ここに示すグラフは、生物学的に活性なビタミンD 3がrun X 2D NA結合に及ぼす影響を連続的にモニタリングした例です。試験した濃度は、ランX 2D NA結合にほとんど影響を与えませんでした。
他のビタミンD3つの化合物は劇的な効果があることが示されていますが。ここで試験した化合物5 2 2 1 9 7 5は、コンピュータ支援薬物設計を使用して同定されました。試験時に、化合物は、1ナノモルから100マイクロモルへのrux 2結合の用量依存的な阻害を示し、renx 2D NA結合の50%は、化合物のわずか0.01マイクロモルで阻害することができました。
このビデオを見た後、DNA結合アッセイの実施方法とDNA結合の潜在的な阻害剤の試験方法についてよく理解できるはずです。
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概要
本記事では、転写因子を中心としたタンパク質-DNA相互作用を研究するために設計された定量的DNA結合アッセイを紹介します。このアッセイでは、ストレプトアビジンコーティングプレートとビオチン化DNAを用い、比色測定を通じてRUNX2タンパク質の相互作用の検出を容易にします。
研究の主要構成要素
科学分野
- 生化学
- 分子生物学
- 転写調節
背景
- タンパク質とDNAの相互作用を理解することは、遺伝子発現の調節において極めて重要です。
- 転写因子は、細胞プロセスや疾患メカニズムにおいて重要な役割を果たしています。
- 転写調節因子を特定するためには、定量的なアッセイが不可欠です。
- 比色検出法を用いることで、相互作用のリアルタイムモニタリングが可能になります。
研究の目的
- DNAへの転写因子の結合を測定するための信頼性の高いアッセイを開発すること。
- 遺伝子発現の潜在的な転写調節因子を同定すること。
- タンパク質-DNA相互作用解析を通じて、新規抗腫瘍剤を探索すること。
使用方法
- ストレプトアビジンコートアッセイプレートの調製。
- 結合アッセイにおけるビオチン化DNAターゲットの使用。
- 核抽出物タンパク質および潜在的な阻害剤の添加。
- 特異的抗体を用いた結合転写因子の検出。
主な結果
- コンセンサスDNA認識オリゴヌクレオチドを用いることで、RUNX2に対する高い特異性を達成した。
- リアルタイムの比色検出を正常に実装した。
- 本アッセイにより、タンパク質-DNA相互作用の効果的な測定が実証された。
- 転写調節因子の特定における潜在的な応用可能性が強調された。
結論
- 開発されたこのアッセイは、転写因子の相互作用を研究するための有用なツールとなります。
- がん研究における新たな治療標的の発見に寄与することが期待されます。
- 今後の研究により、さまざまな生物学的背景における本アッセイの応用範囲が拡大される可能性があります。
よくある質問
産業上の重要性
タンパク質-DNA相互作用の定量的な評価は、初期創薬におけるターゲットの妥当性確認およびメカニズムのデリスキングにおいて極めて重要です。このD-ELISAアッセイにより、転写因子の結合能および阻害剤の効果を精密に測定することが可能となり、腫瘍学や遺伝子調節のポートフォリオにおける重要な局面での予測的な信頼性を向上させます。その定量的な出力結果は、さらなる開発に向けた候補モジュレーターの堅牢な選別および優先順位付けを容易にします。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 転写因子とDNAの結合を直接的に解析し、機能的なターゲット検証を可能にします。
- タンパク質とDNAの相互作用に対する阻害剤の効果を定量化することで、メカニズム的なリスク低減をサポートします。
- パスウェイ調節およびターゲットエンゲージメントにおける予測精度の向上を促進します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- DNA結合阻害剤をスクリーニングするための、定量的で再現性のあるプラットフォームを提供します。
- 比色読み取りを用いて、転写因子の活性検出を標準化します。
- 化合物評価に適した、拡張可能なマルチウェルアッセイ形式を可能にします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 腫瘍学モデルにおける疾患関連の転写調節と一致します。
- 抗腫瘍剤の発見から前臨床検証までの継続性をサポートします。
- 関連システムにおいて標的変調を確認することで、生物学的リスクを低減します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この定量的なDNA結合アッセイは、標的のバリデーション、リード化合物の同定、および転写調節因子のトランスレーショナルリサーチを繋ぐことで、創薬から前臨床試験に至る一連の流れに組み込まれます。
- 探索生物学：転写因子とDNAの相互作用を定量化し、パスウェイの役割を明確にし、ターゲットを検証します。
- スクリーニング：阻害剤スクリーニングおよびアッセイの標準化に向けて、再現性のある定量的な出力を提供します。
- 分析：結合および阻害の比較分析のための吸光度ベースの測定を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：遺伝子調節をターゲットとした抗腫瘍剤候補の前臨床評価をサポートします。
- エンタープライズ再利用：多様なタンパク質-DNA相互作用研究に適応可能な、再利用可能なプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： ターゲット検証における予測の信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを軽減する。
- 運用的価値： アッセイの再現性、スケラビリティ、およびチーム間での標準化を向上させる。
- 戦略的価値： 強固な阻害剤評価を可能にすることで、go/no-go判断および資本効率を改善する。
- ポートフォリオへの影響： リスク調整後の優先順位付けと、転写調節因子プログラムの推進を支援する。
実施上の検討事項
- タンパク質抽出、抗体を用いた検出、および定量アッセイ設計における専門知識が必要です。
- マルチウェルプレートリーダーおよび検証済みの抗体試薬へのアクセスが必要です。
- 再現性を確保するため、コントロールおよびアッセイ条件のチーム間での標準化が求められます。
- 適切な最適化を行うことで、さまざまな転写因子やDNA標的に適応可能です。
- 意味のある定量的な出力を得るために、厳格な特異性コントロールに依存します。
