人間の脂肪吸引物からの脂肪由来幹細胞を手動で隔離

本手順の全般的な目的は、脂肪吸引物として得られた脂肪から脂肪由来幹細胞を単離することです。まず、手術用溶液を除去し、吸引物から混入した赤血球を洗浄することでこれを達成します。次に、洗浄した脂肪吸引物をコラゲナーゼで酵素消化し、幹細胞を遊離させます。

次に、ストローマ血管分画（SVF）として放出された細胞を遠心分離によって回収します。最終ステップとして、上澄みを除去し、接着性のASCを選択および培養するためにSVF細胞を播種します。最終的に、これらの培養されたASCを骨、脂肪、および軟骨へとin vitroで誘導します。

リネージ解析を用いることで、これらの細胞の多能性を確認することに加え、培養物内におけるこれらの細胞の存在を確認することができます。一般的に、この手法に不慣れな方は、細胞回収前の大量の脂肪吸引液を扱うというロジスティクス上の問題に苦労することがあります。滅菌済みのコラゲナーゼType I溶液と滅菌済みのコントロール培地を準備してください。

吸引した脂肪組織を吸引容器に回収します。回収した脂肪組織を、滅菌済みの1Lガラスビーカーに注意深く移します。重力によって脂肪組織の層が分離したら、上層にオイル層がある場合はそれを吸引して除去します。

また、下層の不純物を取り除きます。得られた脂肪組織層の量を測定してください。同量の滅菌1×PBSを加え、吸引に使用したピペットで撹拌します。

2層に分離した後、10 milliliterのセロロジカルピペットを用いて上清を吸引します。脂肪層が黄金色になるまで、PBSで脂肪組織画分の洗浄を繰り返します。最後にもう一度上清を吸引し、脂肪組織画分のみを残します。

ガラススピーカー内で行います。最後の洗浄後、最終的な吸引を行う前に、リッポ吸引層を5分間静置させます。フィルターユニットを用いて、滅菌済みのコラゲナーゼI溶液を調製します。

脂肪分と同量の溶液を加え、滅菌フィルターでろ過します。次に、洗浄した脂肪分をコラゲナーゼ溶液に慎重に注ぎ、ボトルをしっかりと密閉します。その後、コラゲナーゼ脂肪混合液を37 °Cの恒温水槽で30分間インキュベートし、5〜10分ごとに緩やかに撹拌します。消化が進むにつれて脂肪組織層が滑らかになっているかを確認し、必要に応じて反応時間を延長して、固形脂肪塊を完全に溶解させます。

消化後のコラゲナーゼ脂肪混合物が入ったフィルターユニットを70% ethanolで滅菌し、バイオセーフティキャビネットに戻します。次に、ストローマ血管分画を含む上清を25 milliliterずつ分注し、滅菌済みの50 milliliter遠心チューブに入れます。各チューブに25 millilitersのコントロール培地を加え、室温で5分間インキュベートしてコラゲナーゼを不活化させます。

次に、バイオセーフティキャビネット内で1,200 ×gで10分間遠心分離し、ストローマ血管分画をペレットとして回収します。各チューブから上澄み液を吸引します。この際、最上層のオイル層と浮遊している脂肪細胞も合わせて吸引してください。

次に、30 mLの調整培地を用いてSVFペレットを1本の遠心チューブにまとめ、さらに2本の新しい50 mL遠心チューブに等量ずつ分注します。遠心分離後、2つのペレットから上清を吸引除去します。赤血球（RBC）の溶血を行う場合は、これら2つのペレットをそれぞれ10 mLのRBC溶血バッファーに再懸濁し、室温で10分間インキュベートします。遠心分離後、上清を吸引除去して、ストローマ血管分画（SVF）のペレットを得ます。

これら2つのペレットを1本の新しい遠心チューブにまとめます。5～10 mLのコントロール培地を用い、新しい50 mL遠心チューブの上に設置した100 µmのメッシュフィルターを使用して、大きな組織粒子をろ過して除去します。次に、脂肪幹細胞を含むろ過分画を組織培養皿に分注します。

その後、各ディッシュに適切な量のコントロール培地を補充します。培地で3〜4日間、交換せずに培養します。培養培地を吸引し、コンタミネーションした赤血球を除去するために、滅菌PBSで細胞を1回洗浄します。その後、培地を補充し、培養を継続します。大量の脂肪吸引サンプルからストローマ血管分画（SVF）を分離するために、この手動酵素法を使用します。

得られた培養A SC集団は外見的に比較的均質であり、検証の最も一般的な手段として、線維芽細胞様細胞で構成されていることが示されます。規定の培養条件下でA SC集団をin vitro誘導すると、中胚葉、外胚葉、および内胚葉の系譜への分化が起こります。このようにin vitroで三胚葉分化能を持つことから、ASCは多種多様な再生モデルシステムに利用されています。

脂肪細胞、骨細胞、および軟骨細胞への分化は、一般にASCを同定し、その多能性を確認するのに十分です。さらに、ASCは骨格筋原性および平滑筋原性細胞、外胚葉系の細胞、あるいは内胚葉系の肝細胞系へと分化させることも可能です。このビデオを視聴することで、脂肪組織から基質血管分画を分離する方法について十分に理解できるはずです。

Turingにおいては、これはSCコンポーネントとなります。