CometChip：マイクロアレイヒト細胞におけるDNA損傷を測定するためのハイスループット96ウェルプラットフォーム

この手順の全体的な目標は、COMETチップを使用して哺乳類細胞でハイスループットのDNA損傷測定を行う方法を実証することです。これは、最初に哺乳類細胞をCOMETチップにロードすることによって達成されます。2番目のステップは、DNA損傷を引き起こすことが知られている化学物質で細胞を処理することです。

次に、細胞を溶解し、従来のCOMETアッセイプロトコルを使用してElectro Eastします。最後のステップは、損傷したDNAの移動を視覚化するための細胞DNAの蛍光イメージングです。最終的には、DNA損傷の程度を定量化するために、画像解析ソフトウェアが使用されます。

comアッセイは本当に長い間存在しており、さまざまな種類のDNA損傷を調べるのに非常に有用なアッセイです。しかし、問題は、スループットが非常に低く、感度が不足していることです。そこで、COMETチップを作成しましたが、これは基本的にCOMETアッセイの非常にハイスループットなバージョンであり、例えば薬物スクリーニングや疫学研究のためのハイスループットスクリーニングを可能にします。

私の研究室のJing GA大学院生が手順を実演します。コマチップは、1つのウェル長方形のプレートゲル結合フィルムを下にして配置を開始するために、単一セルと同じくらい小さい直径のマイクロポストを備えたマイクロ加工スタンプから製造されたマイクロウェルの配列を備えたゲルです。ゲルを1つのXPBSで25ミリリットルに2回洗浄した後、コンマチップをガラスプレートにセットし、それに応じてゲルの向きをラベル付けします。

次に、逆さにしたボトムレス96ウェルプレートをゲルにそっと押し込み、すべての96ウェルがゲルの領域内にあることを確認します。次に、96ウェルプレートの両側を1.5インチのバインダークリップでガラスプレートにクリップします。最後に、それぞれから余分なPBSを吸引します。

標準的な手順に従って懸濁液または付着細胞をよく収穫し、細胞を培地で最終濃度100、000〜1ミリリットルあたり100万個に希釈します。必要に応じて、セルフィルターを通過して単一セル懸濁液が得られることを確認してください。各ウェルに100マイクロリットルの細胞懸濁液をピペットで入れ、終了したらコメットチップ96ウェルプレートにする。

プレートをゲルボンドフィルムで覆って蒸発を防ぎ、インキュベーターからプレートを取り出した後、37°Cに設定したインキュベーターに30分間置いてください。30分が経過したら、それぞれから培地を吸引し、バインダークリップと底なしの96ウェルプレートを取り外し、ガラスプレートで彗星チップを斜めに保持し、1つのXPBSで穏やかにすすぎ、アロスの上の余分な細胞を取り除きます。次に、明視野顕微鏡の4倍対物レンズを通してプレートを観察し、最適な細胞負荷を確認します 十分な細胞がロードされた後、comチップを均一な表面に配置し、摂氏37度に予温された1%低融点のアグロスを重ね合わせます。

オーバーレイを室温で3分間固化させ、次に摂氏4度で5分間置いて、目的の化学物質を細胞に完全に投与します。まず、コメットチップのウェルを新しい底なしの96ウェルプレートのウェルに慎重に位置合わせし、押し下げます。96ウェルプレートを以前と同様にバインダークリップでガラスプレートに固定します。

次に、プレートを氷の上に置き、目的の化学物質を所望の用量で100マイクロリットル加えます 各ウェルに、調査中の化学物質を投与後所望の期間で細胞上に残し、各ウェルから化学溶液を吸引し、必要に応じて1つのXPBSですすいでください。ゲルを別々の部分に切ります。次に、修復速度論を研究するために、培地をウェルに添加し、インキュベートし、アルカリコメットアッセイのために特定の時点でLY細胞に細胞溶解を進めます。

アルカリ溶解原液に1%Triton X 100を添加することにより、各チップに約25ミリリットルの作業用アルカリ溶解バッファーを調製します。その後、摂氏4度で事前に冷やします。アルカリ溶解バッファーをコメットチップよりも少し大きい容器にデカントします。

次に、アルカリチップを冷蔵した作業用アルカリ溶解緩衝液に沈め、冷蔵庫の場所で溶解を摂氏4度で一晩進行させます。翌日、コメットチップを溶解バッファーから取り出し、1つのXPBSで迅速に再溶解します。次に、チップをゲルフィルム面を下にして電気泳動チャンバーに入れ、両面テープで固定します。

チャンバーを摂氏4度の冷蔵室に持っていき、ゲルをちょうど覆うレベルまでチャンバーを冷たいアルカリ電気泳動バッファーで満たします。その後、チップを摂氏4度に40分間放置して、アルカリ性巻き戻しを可能にします。最後に、ゲルを1ボルト/センチメートル、300ミリアンペアで30分間泳がせます。

冷蔵室では、チャンバー内の電気泳動バッファーの容量を調整して、目的の走行電流を実現します。中性コメットアッセイでは、中性溶解ストック溶液に1%Triton X 110%DMSOを添加して、機能する中性溶解バッファーを作製します。繰り返しになりますが、各チップに対して約25ミリリットルの作業用溶解バッファーを準備します。

作業中の中性溶解バッファーを摂氏43度に設定したインキュベーターに置き、予温します。中性溶解バッファーを温めた後、コンマチップをニュートラル溶解バッファーに浸し、摂氏40度のインキュベーターに一晩置きます。翌日、中性溶解バッファーを取り出し、次に中性電気泳動バッファーで摂氏4度で15分間2回再溶解します毎回、チップを電気泳動チャンバーに固定し、冷蔵室に移します。

前回と同様に、電気泳動チャンバーを冷間中性電気泳動バッファーでゲルを覆うだけのレベルまで満たし、ゲルを冷蔵室に60分間置いて、0.6ボルト/センチメートル、6ミリアンペアでゲルを冷蔵室で60分間泳動します。ここでも、必要に応じて、チャンバー内の電気泳動バッファーの容量を調整して、目的の走行電流を実現します。コールドルームからCOMチップを取り出した後、4°Cで15分間ずつ2回洗浄し、中和バッファーを洗浄してゲルを中和します。

cybergゴールドや臭化イリジウムなどの蛍光DNA染色が付着したチップ内に留まります。製造元の指示と蛍光顕微鏡を使用した画像によると、未処理のTKから6つのリンパ芽球を代表するマイクロウェル彗星がこの図の上部パネルに示されています。TK 6細胞のものは、中央のパネルで50マイクロモルの過酸化水素に、下部のパネルで100マイクロモルの過酸化水素に曝露されました。

すべての露光は摂氏4度で20分間行われました。この折れ線グラフは、TK 6個の細胞の過酸化水素線量応答を示しています。各データポイントは、各実験で少なくとも50個の個々の彗星のテールDNAの中央値が得られた3つの独立した実験の平均です。

このグラフは、TK 6細胞のコンマチップアッセイのサンプル間変動を示しており、各ウェルの過酸化水素パーセントテールDNAデータがここに示されている。各ボックスは、各ウェルからの少なくとも50個の個々の彗星の中央値を表しています。12ウェルの平均は77ポイント53%、標準偏差は3.99%、変動係数は5.2%このグラフは実験間の変動を示しています。

同じ過酸化水素曝露を6回繰り返し、各繰り返しのデータを灰色のバーで示しています。各ボックスは、各リピートから得られた少なくとも100個の個々の彗星のテールDNAの中央値を表しています。6回のリピートの平均は49.57%で、ここではバックバーとして表示されています。

6回の繰り返しの標準偏差は4.99%で、平均のエラーバーは2.04%で、図のエアバーとして表されています。研究者は、この手順を自由に変更したり、精製された病変特異的酵素を含めるなど、他の混乱を使用して、細胞内で生成されるDNA損傷の種類に関する追加の質問に答えることができます。コメットチップ技術は、哺乳類の細胞がDNAの損傷と修復について学ぶための研究への道を開きました。

また、ハイスループットであるため、以前はサンプル数が多いために不可能だった臨床研究や疫学研究が可能になります。