DNAマイクロアレイ：サンプルの品質管理、アレイハイブリダイゼーションとスキャニング

この手順の全体的な目的は、自動ミキサー装置を用いてマイクロアレイ実験を行うことです。まず、RNA増幅および標識後のRNAサンプルの品質をバイオアナライザーで分析し、その後、RNAサンプルをマイクロアレイにハイブリダイゼーションさせます。

最後に、ハイブリダイゼーション後のマイクロアレイを洗浄し、スキャンします。最終的に、2色蛍光マイクロアレイ画像の解析を通じて、RNA転写物の差分的発現を示す結果が得られます。マイクロアレイのハイブリダイゼーション手順は専門的な装置を使用するため習得が困難であり、本手法を視覚的に提示することは非常に重要です。

品質管理分析は、記載された手順に従い、2, 100 bioanalyzer装置およびチッププライミングステーションの準備から開始します。次に、RNA 6, 000 nano kitに付属のスピンフィルターにゲルマトリックスを550 µL分注してろ過します。フィルターを室温で1, 500 RCFにて10分間遠心分離します。

次に、ろ過したゲルを65 µLずつ分注し、4 °Cで最大1か月間保存します。染料濃縮液を10秒間ボルテックスし、65 µLの分注液に1 µL加えます。混合物をボルテックスした後、ろ過したゲルを室温で13,000 RCF、10分間遠心分離し、サンプルを分析に供します。

まず、プライミングステーションにチップを配置します。このデモンストレーションでは、RNA 6,000 nano chipを使用します。黒い背景に白字でGと記されたウェルに、ゲル染色剤ミックスを9 µLロードします。

ピペットチップをウェルの最底部に配置します。シリンジプランジャーを1 mLの位置に合わせ、プライミングステーションを閉じます。クリップで固定されるまで、プランジャーをゆっくりと、かつ一定の速度で押し下げます。

30秒後、クリップを外し、プランジャーが数秒間上昇するまで待ちます。プランジャーが停止した後、プランジャーを1 mLの位置まで引き戻し、プライミングステーションを開きます。ゲル染料を9 µLロードします。

2つのウェルのそれぞれで混合します。マーカーGを標記します。次に、5 µLのマーカーをラダーウェルおよび12個のサンプルウェルのそれぞれに分注します。続いて、1 µLの変性ラダーをラダーウェルに、そして1 µLずつの各変性サンプルをサンプルウェルにロードします。

最後に、未使用の各サンプルウェルにマーカーを1 µLずつ加えます。ロード後、チップを2,400 RPMで1分間ボルテックスします。2,100 expertソフトウェアを起動した後、チップをセットして蓋を閉じます。

正しいポートが選択されていることを確認し、蒸発を防ぐため、サンプルをロードしてから5分以内にアッセイを実行してください。RNA増幅および標識の手順については、書面によるプロトコルを参照してください。標識後、cogens r an easy mini columnsを用いてCRNAを精製し、未反応のヌクレオチドを除去します。その後、NanoDrop 2000分光光度計を用いて標識CRNAを定量します。

マイクロアレイ測定モードにおいて、サンプル濃度、収量、および比活性を記録します。マイクロアレイハイブリダイゼーションを行うには、ハイブリダイゼーションの少なくとも2時間前に、825 nanograms以上の収量およびmicrogramあたり少なくとも8 picomolesの比活性を確保する必要があります。ハイブリダイゼーションステーションの電源を入れ、65 °Cに設定します。

このプロトコルでは、Roche NimbleGenハイブリダイゼーションシステムおよび4つのミキサーチャンバーを用いたAgilent 4x40 4Kアレイの使用方法について説明します。書面によるプロトコルに従ってcRNAフラグメンテーションを行った後、ハイブリダイゼーションチャンバーを準備します。マイクロアレイスライドのバーコード側をアセンブリ・ディスアセンブリツールに設置します。まず、A4ミキサーを開き、アレイとアセンブリ・ディスアセンブリツールを固定している接着剤を露出させて、いかなる動きも防ぐようにします。

スライドの端からA4ミキサーを配置します。ツールに対して正しく整列していることを確認し、アレイに沿ってミキサーを接着します。ミキサーの端からスライドを引いて、スライドミキサーアセンブリを取り出します。

ブレイイングツールを使用して、接着ガスケットに沿って全体的に押し付け、スライドにしっかりと接着していることを確認します。接着剤とスライドの間に閉じ込められた小さな気泡は、暗い背景に対して視認できます。ブレイイングツールを用いて、これらの気泡を完全に取り除いてください。

これでアレイにサンプルをロードする準備が整いました。ポジティブディスプレイスメントピペットを使用して、ハイブリダイゼーションサンプルを100 µL分ロードします。チップをポートホール内にしっかりと押し込み、アレイ領域に空気が溜まらないよう、ゆっくりとスムーズに分注してください。

サンプルがアレイ全体を覆い、ベントポートから液体が出始めたら、プランジャーを離すだけで、速やかにピペットを遠ざけます。チップをスライドから離した後、チャンバー自体からサンプルを吸い出さないように注意しながら、両方のポートにある過剰な液体を優しく吸い取ります。その後、ピンセットを使用して、ポートホールにステッカーを貼って封止します。

スライドをハイブリダイゼーションステーションに設置し、ブラダー孔がOリングの上に正しく配置されていることを確認します。これにより、ハイブリダイゼーション中の適切なミキシングが確保されます。スライドカバーとステーションの蓋を閉じます。

ステーションをミキシングモードBに設定し、アレイを65 °Cで17時間ハイブリダイズさせます。完了後、洗浄バッファー1を満たしたAとラベル付けされたガラスディッシュを用意します。ディッシュは、アセンブリ・ディサセンブリツールを収容し、操作に十分な余裕がある大きさである必要があります。プラスチックは化合物を溶出させ、アレイのバックグラウンドが高くなる傾向があるため、すべての洗浄はガラス器具を用いて行ってください。

スライドラックとスターラーバーを染色皿に入れます。Bとラベルを付けた皿に、ラックが浸かるまで洗浄バッファー1を満たし、室温のスターラープレート上に置きます。同様に、Cとラベルを付けた空の染色皿にスターラーバーを入れ、スターラープレート上に置きます。

ハイブリダイゼーションステーションからアレイを取り出し、アセンブリ分解ツールにセットします。片手でアセンブリ分解ツールとスライドを反対側から保持しながら、アセンブリ全体をディッシュに浸します。アレイ領域に傷がつかないよう注意しながら、A4ミキサーを慎重に剥がします。

スライドをラックと染色皿Bに迅速に配置します。SCI five染料はオゾンに敏感であるため、空気への露出を最小限に抑えてください。中速で撹拌しながら、1分間洗浄します。温めておいた洗浄バッファー2で染色皿Cを満たします。

スライドを移し、1分間洗浄します。洗浄後、スライド上に残る液滴を最小限にするため、染色容器Cからスライドラックを非常にゆっくりと取り出します。2分間スピンさせてスライドを乾燥させます。

次に、スライドを50 milliliterのコニカルチューブに入れ、アルゴンガスを満たします。信号の減衰を防ぐため、Molecular Devices社のGenePix 4000Bスキャナーを用いて直ちにスキャンを行います。ここでは、ヒト脳から単離した4つのRNAサンプルの例を示します。腫瘍組織サンプルの品質は、RNA 6,000チップを用いた2,100 Bioanalyzerで評価しました。

塗りつぶした矢印と白抜きの矢印は、それぞれ18 Sおよび28 S-R-R-N-A種の位置を示しています。RNA整合性番号（RIN）は、RNA品質の定量的測定値です。品質の良い全RNAサンプルを品質管理のためにバイオアナライザーで解析すると、2つの主要なリボソームRNA種に対応する2つの主要なピークのみが検出されるはずです。

一部のRNA分解は、最初のリボソームRNAピークの前にスメアとして現れ、著しく分解が進んでいる場合は28 S-R-R-N-Aのピークが大幅に低くなります。低品質なRNAでは、保持時間が短い領域に広範なピークまたは一連のピークが現れます。その際、2つのリボソームRNAピークは強度が非常に低くなるか、あるいは全く特定できなくなります。

高品質なアレイでは、比較的低いPMT値で高いシグナルが得られるはずです。ほとんどの転写産物は、実験サンプルとリファレンスサンプルで同程度のレベルで存在することが期待されます。遺伝子発現に大規模かつ広範な変化が見られる場合は、生物学的な有意性に欠ける可能性が高いと考えられます。

したがって、アレイの大部分は緑色や赤色ではなく、黄色に見えるはずです。また、良好な品質のシグナルは、アレイ画像の散布図に見られるように、シグナルのヒストグラムが完全に重複するダイナミックレンジ内にある必要があります。このビデオを視聴することで、自動ハイブリダイゼーション装置を用いたマイクロアレイ実験の実施方法について十分に理解できたはずです。