初代ヒト肝細胞と非実質肝細胞の対応する主な集団の単離のためのプロトコル

この方法は、肝臓学および毒物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ち、新しいin vitro共培養および組織工学肝臓モデルの開発の機会を提供します。この新しい技術の利点は、同じドナーと同じ肝臓組織からすべての肝細胞集団を分離できることです。この手順を開始するには、剖検したばかりの肝臓組織を煩雑な条件下で秤量し、肝臓組織サンプルを層流フードに入れます。

次に、組織サンプルの表面から血液を取り除きます。次に、1X Perfusion solution oneを使用してカニューレを洗浄します。ティッシュ接着剤を使用して、カニューレのオリーブを大きな血管に固定します。

次に、灌流をテストし、カニューレの漏れを確認します。その後、透明な1X灌流溶液が漏れているすべての血管を組織接着剤で閉じます。その後、カニューレ挿入された肝臓組織サンプルをBuchner漏斗に入れます。

次に、蠕動ポンプの流量を、使用するカニューレの数と肝臓組織の抵抗に応じて、毎分7.5〜14.6ミリリットルに設定します。全血が少なくとも20分間、最大30分間洗い流されるまで、組織を灌流します。場合によっては、カニューレの1つをプラスチック製のクランプで固定するか、灌流を最適化するためにヘラで肝臓カプセルを柔らかく押して領域の内圧を上げる必要があります。

茶色がかった赤から薄茶色または淡黄色への完全な色の変化は、良好な灌流を示します。その後、灌流液をコラゲナーゼPを含む消化液に変更し、消化ステップのセットアップを再配置します。その後、消化液の循環流を最大15分間実行します。

定期的に灌流を停止し、消化の程度を確認してください。肝臓組織サンプルが十分に消化されたら、消化液による灌流を直ちに停止することが不可欠です。準備ができたら肝臓をデバイスから取り出し、ガラス皿に入れます。

組織サンプルの外側を氷冷ストップ溶液ですすいでください。肝臓組織サンプルからカニューレを取り出します。次に、メスを使用して、カニューレが取り付けられた領域の中央を切開して肝臓組織サンプルを開き、グリッソンのカプセルが無傷のままであることを確認します。

組織サンプルの内側をすすぎ、組織サンプル全体をストップ溶液で覆います。次に、組織を静かに振って、細胞を組織から放出します。次に、細胞懸濁液を回収し、ガーゼ漏斗でろ過して50ミリリットルのプラスチックチューブ10本に入れます。

肝臓組織サンプルにストップ溶液をさらに追加し、最終容量が500ミリリットルになるまで使用します。その後、細胞懸濁液を遠心分離し、後でNPC単離のために上清を回収し、細胞ペレットを250ミリリットルのプラスチックチューブにプールします。続いて、細胞ペレットをPBSで洗浄します。

そのためには、細胞懸濁液を遠心分離します。上清を採取し、ペレットをプールし、ペレットを肝細胞培養培地に再懸濁します。次に、得られた細胞懸濁液中の細胞数と生存率をトリパンブルー染色で測定します。

非実質性肝細胞を単離するには、採取した上清を遠心分離して、残りの赤血球と肝細胞を除去します。上清を収集し、それらを2回遠心分離して、HCS、LEC、部分的にKC、および残りのKCを沈降するための細胞ペレットを取得します。次に、ペレットをHBSSに再懸濁します。次に、密度勾配溶液とPBSを混合して密度勾配遠心分離を行い、25%と50%の密度勾配を調製します。

密度 25% のグラデーション溶液を 50% 密度のグラデーション溶液層の上に慎重に配置します。次に、NPC懸濁液を25%密度の勾配溶液層の上に注意深くゆっくりと置き、両方の層が明確に分離されるようにします。細胞懸濁液を密度勾配上で中断することなく遠心分離します。

NPCは、25%と50%の密度勾配層の間の間期に位置しています。最上層から死んだ細胞と細胞の破片を吸引し、間期を慎重に収集します。デュアル遠心分離後、KCおよびMPCフラクションの細胞カウントを行います。

次に、前述のデュアル遠心分離ステップでNPC画分を遠心分離し、NPCをKupffer Cell播種培地に再懸濁します。KC含有画分をプラスチック細胞培養容器に、10の5倍から1平方センチメートルあたり5番目のKCの密度で播種します。KC培養物を加湿インキュベーターで摂氏37度、二酸化炭素5%で20分間インキュベートします。

初代KCは、短時間で細胞培養プラスチックに付着する必要があります。次に、LECとHSCを主成分とする非付着NPCを含む上清を回収します。LECをHSCから分離するには、まず上清の遠心分離から始めます。

次に、ペレットをPBSで洗浄します。2回目の遠心分離後、細胞を星状細胞内皮細胞分離培地に再懸濁し、残りのすべての細胞の細胞カウントを行います。次に、1000万個の細胞を1ミリリットルの星状細胞内皮細胞分離培地に再懸濁します。

次に、MAXキットから20マイクロリットルのブロッキング溶液と20マイクロリットルのCD31マイクロビーズを免疫標識用に加え、得られた懸濁液を摂氏4度で15分間インキュベートします。その後、磁気活性化セルソーティングシステムmaxの製造元のプロトコルに記載されているように、LECをHSCから分離し、HSCフラクションを収集します。磁気保持されたCD31陽性LECを溶出し、星状細胞内皮細胞培養培地に懸濁します。

ここで、これらの画像は、位相差顕微鏡で単離プロセスの直後のさまざまな単離肝細胞集団を示しています。この一連の画像は、培養の24時間後に分離され、培養された細胞を示しています。ここでは、さまざまな細胞画分の免疫蛍光法による特性評価を示します。

PHHは単離後24時間で肝細胞マーカーCK18に対して陽性のシグナルを示し、KCは単離後24時間でマーカーCD68に対して陽性を示し、LECは単離後72時間でビメンチンに対して陽性のシグナルを示し、HSCは単離後72時間でGFAPに対して陽性を示しました。この手順を試行する際、分離が成功するかどうかは、肝臓組織サンプルの最適な消化にかかっていることを覚えておくことが重要です。このビデオを見た後、この手順の重要なステップである消化の制御方法と密度勾配分離の実行方法について十分に理解しているはずです。

この技術は、その開発後、医学研究の分野の研究者が、新たに作成されたin vitro細胞培養および組織改変肝臓モデルで肝臓の機能と疾患を探求する道を開きました。