フォワード遺伝的アプローチでクラミジアトラコマチス

この手順の全体的な目標は、化学突然変異誘発を実施し、遺伝子型の表現型との関連を決定することにより、クラミジアトリタスの遺伝子分析を実行することです。これは、最初に化学変異誘発を使用してクラミジアtracom変異株を生成することによって達成されます。次に、全ゲノムシーケンシングにより、すべての化学的に生成された変異を同定し、続いて参照誘導ゲノムアセンブリを同定します。

次に、変異株の表現型遺伝子型の関連性が特定されます。最後に、表現型遺伝子型の関連性は、組換え株を生成して分析することにより確認されます。最終的には、特定のクラミジア遺伝子の突然変異が、古典的な化学突然変異誘発アプローチと次世代のSinghの組み合わせを通じて、関心のある表現型につながることを示す結果を得ることができます。

現在、クラミジアの遺伝子置換に利用できる方法はなく、その研究のための分子遺伝学的ツールは初期段階にあります。この方法は、組換えDNAによる形質転換や分子遺伝学的ツールの開発を必要とせず、同じ目標を達成します。それは、個々の遺伝子産物に機能を割り当てることです。

培養細胞を調製するには、10%FBSを添加した3ミリリットルのDMEMに25cm四方あたり6個のvir細胞のうち約10倍を座らせ、5%の二酸化炭素で摂氏37度でインキュベートします。細胞が約24時間後にコンフルエントに達したら、培地を吸引し、5回の感染の多重度で細胞をクラミジアに感染させます。シクロヘキシミド1ミリリットルあたり200ナノグラムを含むD-M-E-M-F-B-Sの総量3ミリリットルで、化学フードの下で感染後18時間で突然変異誘発を開始するために、塩化カルシウムと塩化マグネシウムを含むPBS中のエチルメタンスルホン酸またはEMSの1ミリリットルあたり20ミリグラムを調製します。

EMSは強力な変異原性および発がん性物質です。したがって、その廃棄についてはテキストプロトコルを参照してください。Vero細胞から培地を吸引し、塩化マグネシウムと塩化カルシウムを含む3ミリリットルのPBSで1回洗浄します。

その後、3ミリリットルのEMS溶液で、ヒュームフード内で室温で1時間インキュベートします。インキュベーション後、EMSを取り出し、1モルの水酸化ナトリウムの容器に入れて変異原を不活性化してから、細胞を3回洗浄して残留EMSを除去します。次に、6ミリリットルのDMEMで10%FBSを10%FBSで、シクロハイデ1ミリリットルあたり200ナノグラム、ゲンタマイシン1ミリリットルあたり25マイクログラムで、摂氏37度で5%二酸化炭素と48〜72時間インキュベートします。

封入物は、突然変異誘発の約36時間後の72時間で細菌を欠いているように見えます。介在物の約10%はバクテリアで満たされていますが、残りは空のままで、低張溶解法による素体またはEBSを完全に吸引して培地を抽出します。1ミリリットルの水を加え、10分間揺らして細胞を取り除き、ピペッティングで10回以上上下させて細胞を溶解します。

マイクロフュージチューブにライセートを回収した後、最終濃度の1倍に5×スクロース、リン酸グルタミン酸緩衝液、またはSPGを0.25ミリリットル加え、マイナス80°Cで保存します。ウェルあたり3ミリリットルのDMEM 10%FBSに6つの細胞の約0.4倍の10を播種することにより、6つのウェルプレートにves細胞のコンフルエント単層を設定し、細胞が次の24時間で均質な単層を形成することを可能にします。来週の秋は氷の上に、クラミジアの変異原菌の原液です。

次に、DMEM 10%FBSで希釈あたり総容量200マイクロリットルの10倍段階希釈の6本のチューブを準備し、氷上に置きます。PBSのウェルあたり3ミリリットルを使用して、Vero細胞を2回洗浄します。次に、各ウェルに3ミリリットルのDMEMを6枚のウェルプレートと100マイクロリットルの細菌希釈液を二重に加えます。

プレートを回転させて、均一に混合します。感染したプレートを2, 700 GSで摂氏15度で30分間回転させます。次に、加湿した5%二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で1〜2時間インキュベー

その間に、まず以下の材料を混ぜ合わせて混合することにより、DMEMで0.54%AROSを調製します。その後、18.9ミリリットルの熱い滅菌液、1.2%のアロスを水に混ぜて、塊を防ぐために攪拌します。55°Cの水浴で混合物を温めてください。

皿から細菌懸濁液を吸引し、6ミリリットルの温かいaro溶液を追加します。フードの外側の室温で完全に固化させます。次に、蓋を外したバイオセーフティフードで、プレートが乾いたらプレートをさらに15分間乾燥させ、二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で7〜10日間インキュベートします。

プラークは、突然変異体を単離する1日前に解剖顕微鏡の助けを借りて見えるべきです。ウェルあたり100マイクロリットルの10〜4個のゼロセルを1回見てください。96ウェルプレートでは、細胞は24時間以内にコンフルエントになります。

解剖顕微鏡で、摘み取るプラークに印を付け、滅菌済みの1ミリリットルバリアピペットを使用してプラークのプラグを採取します。Resusは、100マイクロリットルのDMEMにプラークを懸濁し、10%FBS400ナノグラム/ミリリットル、シクロ、ハイデ、および50マイクログラム/ミリリットルを補充しました。ゲンタマイシンを使用して変異株を増殖させ、懸濁液をVero細胞のコンフルエント単層に重ね合わせます。

細胞の50%以上が感染している場合、ハーベストdbsをインキュベートする前に、プレートを2、700GS、15°Cで30分間回転させます。これは、感染後48時間から14日後に発生する可能性があります。この量の感染細胞は、感染細胞の低張溶解によってEVを抽出するのに十分な生存可能な細菌を保存することを可能にします。培地を160マイクロリットルの滅菌水で吸引した後、室温で10分間インキュベートします。

バリアチップを使用して、ピペッティングを数回上下させることで細胞を破壊し、完全な溶解を確保します。最後に、各ライセートの160マイクロリットルをマイクロフュージチューブに移します。5つのXSPGを40マイクロリットル加え、目的の表現型について突然変異体をアッセイおよびスクリーニングする準備ができるまで、摂氏マイナス80度で保存します。

変異原への曝露は、おそらく細菌細胞死による細菌欠如のように見える封入体につながります。通常、血清型LGVL 2は感染後48時間以内に感染細胞を完全にシラミを駆除しますが、変異原による治療はこのサイクルを90時間以上に延長することができ、私たちの実験では約10%の封入体が回復すると予想されます。EMSの1ミリリットルあたり20ミリグラムで処理された感染したVero細胞は、この図に見られるように、未治療の対照と比較して感染性子孫の回復が99%減少しました。

変異原治療はまた、小さなプラークを含む形態の変化したプラークの出現につながりました。他の形態には、ここに示すように、粒状、塊状、またはハニカム形状に見えるプラークが含まれます。これらの研究で使用されたEMSの用量は、NGSによって実験的に評価されるように、KCLゲノムあたり3〜30の突然変異を引き起こす可能性があります。

グラジエント精製EBSは宿主細胞材料をほとんど含まないが、宿主DNAも検出され、この手順に続いてゲノム調製の約10〜15%を占める。組織培養細胞での複製障害、生化学的活性の喪失、細菌形態の変化などの表現型のスクリーニングを行うことで、クラミジア、病原性因子の形成と維持に必要な細菌因子などの追加の質問に答えることができます。