共有結合は、自己組織化単分子膜の手法を用いて表面上のBMP-2の結合

この手順の全体的な目標は、BMPの2つの分子をその生物活性を失うことなく、表面に共有結合させることです。これは、最初に物理蒸着によって基板上に金層を形成することによって達成されます。2番目のステップは、mu NHSA二官能性NHSチオールリンカーの自己組織化単層を作成することです。

次に、RH BMP 2がリンカーに共有結合します。最後のステップは、超音波処理によって非結合BMP 2を除去することです。最終的に、抗体結合アッセイを使用して、BMP 2が表面に正常に結合することを示し、表面結合BMP 2の生物学的活性は、SMA 1 5 8リン酸化を分析することにより細胞内で決定されます。

この方法は、成長因子の細胞表面での受容体への最初の結合がシグナル伝達応答を引き起こすのに十分であるかどうかなど、成長因子生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手順を実演するのは、私の研究室の2人のメンバー、テレサ・ポールとエリザベス・シュワブです。この手順を開始するには、精密ワイプでガラスカバースリップをきれいにし、酢酸エチルとメタノールの1対1の混合物で5分間超音波処理します。

超音波処理後、基質をメタノールですすぎ、窒素流下で乾燥させる。クリーンな基板をスパッタコーティング装置にセットし、チャンバーを排気します。クロムターゲットの最上部にある酸化クロム層を60秒間スパッタリングして除去します。

次に、基板を10ナノメートルのクロム層でコーティングし、続いて40ナノメートルの金層でコーティングします。終了したら、チャンバーから金の基板を取り出し、脇に置きます。金基質を2つのネックの丸底フラスコに移し、DMF中の1ミリモルM-U-N-H-Sで室温で窒素雰囲気下で4時間インキュベー

インキュベーション後、DMFで基質を2分間超音波処理します。DMFとメタノールですすぎ、窒素流下で乾燥させます。RHB MP 2 ストック溶液を PBS 中の 1 モル塩化ナトリウムで希釈し、最終濃度を 1 ミリリットルあたり 3.5 マイクログラムにします。

使用直前に、滅菌済みの10ミリモル水酸化カリウムを使用して、この作業溶液をpH 8.5に調整します。サンプルの上にA-P-D-M-Sリングを置きます。基質を6ウェルプレートに移し、基質表面のみがインキュベーション溶液にさらされるようにします。

次に、官能基化されたM-U-N-H-S基質をRHB MP 2ワーキング溶液と摂氏4度で一晩インキュベートします。インキュベーション上清を除去した後、PBSに1モルの塩化ナトリウムを加え、基質を2分間超音波処理します。終了したら、PBS中の滅菌1モル塩化ナトリウムで基質を3回洗浄し、抗体の非特異的吸収をブロックします。

基質をPBS中の5%BSA中で室温で1時間インキュベートします。その後、抗BMP 2抗体溶液で室温で1時間インキュベートし、終了したら、基質をPBSで2回洗浄し、30秒間超音波処理します。次に、基質をHRP標識二次抗体溶液で室温で30分間インキュベートし、PBSで2回洗浄します。

十分なインフルエンザレッドアッセイを使用して、プレートリーダーシードを570ナノメートルでHRP酵素活性を測定し、プレートリーダーシードを10回から5番目の口C、12筋芽球をウェルあたり6ウェルプレートで増殖培地に注入し、摂氏37度、CO2を5%で24時間インキュベートします。プレートをインキュベーターから取り出したら、ウェルから培地を吸引し、細胞を無血清DMEMで3〜5時間飢餓状態にしてから、官能基性BMP 2基質表面に播種して、短期的なシグナル伝達誘導を調査します。培地を200マイクロリットルの新鮮な無血清DMEMと交換し、37°Cおよび5%CO2でのインキュベーション後、細い先端ピンセットを使用して固定化したBMPを細胞の2つの基質の上に置きます。

基質を静かに取り出し、ピペットで培地を吸引します。次に、PBSで細胞を2回洗浄し、ゲル電気泳動とウェスタンブロッティングを使用して細胞応答の解析に進み、長期的な生物学的活性の解析を行います。前述のように細胞を表面に播種し、摂氏37度、5%CO2、2%FBS中で6日間培養します。

インキュベーション後。蛍光顕微鏡で細胞を画像化し、RH、BMP、固定化されたRH、BMPとインキュベートされた2つの結合面、BMPとインキュベートされた2つの特異的抗体、およびHRPと結合した二次抗体を確認します。表面固定化したRH BMP 2またはI BMP 2を細胞刺激の前後に検出した。

ここに示されているのは、抗BMP 2 IgGによって認識された確認で、RH BMP 2が表面に正常に結合したことです。表面固定化RH BMP 2をamli flu red chole metric assayを用いて定量化し、データは、細胞刺激後もタンパク質が依然として表面で検出され、固定化RHB MP 2を示す表面に対する細胞応答を評価し、未処理の金基質の効果と比較したことを示している。ここでは、C2個のC12細胞を上から接近するRHB MPの2つの官能表面により30分間刺激した。

このモデルでは、BMP 2は細胞の多核筋管への分化を阻害し、骨芽細胞の表現型を誘導します。BMP 2シグナル伝達経路の下流レポーターであるSMAD 1 5 8の活性化は、ここに示すようにウェスタンブロッティングによって解析されます。SMリン酸化は、I BMP twoによる30分間の刺激後に観察されますが、未処理の金サンプルに曝露された細胞ではSMAD 1 58のリン酸化は起こりません。

この結果は、固定化プロセスがBMP 2の短期的な活性を変化させず、I BMP 2が長期的な骨形成分化に影響を与えるかどうかを判断するためのsmadシグナル伝達の初期ステップをトリガーすることを示しています。アルカリホスファターゼの発現レベルを、コレメトリックアッセイによって調査しました。C 2 C 12細胞のアルカリホスファターゼ活性は、無地の金とIBPの2つの表面で細胞を6日間インキュベートした後に測定しました。

I BM P 2つの表面で培養した細胞のライセート中のアルカリホスファターゼ活性は、コントロールと比較して有意に高い吸収を示しました。この結果から、IBP 2がC 2 C12細胞にアルカリホスファターゼの発現を誘導し、IBP 2の効果を調べることが明らかになりました。筋新生Cでは、2つのC 12細胞を金または機能化表面に直接プレーティングし、低血清条件下で培養しました。

6日後、図のようにミオシン重鎖の染色を行った。C 2 C 12細胞は、金基板上の細胞とは対照的に、I BM P 2の存在下でミオシン重鎖陽性筋管を形成することができなかった。この手順に続いて、BMP 2を金ナノ粒子に固定化するなどの他の方法を実行して、追加の質問に答えることができます。

例えば、シグナル伝達応答を効率的にトリガーするためには、固定化されたBMP 2がどれだけ局所的に必要か