SynVivo合成微小血管網を利用した剪断接着マップの生成

次の実験の全体的な目標は、合成微小血管ネットワークを使用した単一の実験から細胞粒子接着の純粋な接着マップを取得することです。これは、まずマイクロ流体デバイスを目的のタンパク質(この場合はアバドン)でコーティングすることによって達成されます。第2のステップとして、ビオチン化粒子を生理学的せん断速度でデバイスに注入し、局所的なせん断速度に応じて異なるパターンでアバドン被覆デバイスに結合します。

次に、ネットワーク内のシアーレート値の計算されたデータベースを使用して、パーティクルのシアー接着マップを生成するために、バインドされたパーティクルの数がカウントされます。その結果、1回の実験で純粋な接着マップを取得でき、従来のパラレルプレートフローチャンバーと比較して時間と試薬を大幅に節約できることが示されました。この技術が線形流路などの既存の方法と比較した場合の主な利点は、1回の実験で共有マップを生成できるため、コストと時間を大幅に節約できることです。

この方法は、薬物送達ビヒクルが目的の標的と結合する能力など、薬物送達の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、細胞固有の病変を理解するためにパドルプレートフローチャンバーを使用していたときでした。しかし、流体条件下では、このアッセイの焦点は、s粒子と細胞の接着に関する基本的な洞察を提供することです。

syn vivoプラットフォームは、がんや中枢神経系の送達、感染や炎症、血栓症、微小循環機能障害など、他のさまざまなシステムに適用できます。マイクロ流体デバイスのステップは習得が難しく、少量のサンプルに慣れること、気泡形成を回避するためのベストプラクティスを視覚的に伝えるのが難しいため、この方法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。この手順を実演するのは、私たちの研究室の研究者であるアシュリー・スミスです。

SynVivo SMNマイクロ流体デバイスは、2セットのパラレルポートで構成されており、1つは表面コーティング、シート用の部分や細胞を流すためのポート、もう1つはアッセイを実行するためのものです。まず、滅菌脱イオン水が入ったペトリ皿にデバイスを完全に沈め、皿を真空状態にします。乾燥させると、デバイスのチャネルからすべての空気が除去されるまで、乾燥剤を作動させることができます。

これを水から取り出す前に、約15分かかります。細い先端鉗子を使用して、水でプライミングされたタイゴンチューブをデバイスの各ポートに配置します。チューブの長さは約1インチである必要があります。

これで、ピペットまたはシリンジを使用してデバイスを水から取り外すことができます。1つのインレットポートチューブの基部の周りに水滴を置きます。チューブを慎重に取り外します。

水滴は、空気がデバイスに入るのを防ぎます。次に、アバドンを1ミリリットルあたり20マイクログラムの濃度で充填した1ミリリットルの注射器を準備します。シリンジを24ゲージのステンレス鋼針に接続し、ジョークランプで使用されていない入口ポートを

チューブをデバイスのインレットポートに挿入します。アバドンを1分あたり1マイクロリットルの流量で10分間注入し、デバイスの完全な灌流を可能にします。フロー時間の終了時。

すべてのチューブをジョークランプでクランプし、デバイスを一晩中4度に置きます。デバイスを室温に戻します。次に、電動ステージと高性能カメラを備えた倒立蛍光顕微鏡にデバイスを置きます。

2ミクロンのビオチン化粒子を1ミリリットルあたり500万粒子の濃度でリン酸緩衝生理食塩水またはPBSに調製します。粒子を1ミリリットルのシリンジに入れます。PBSの2番目の1ミリリットル注射器を準備します。

各シリンジをシリンジポンプにロードし、ピペッターシリンジを使用してニードルとチューブに接続するだけです。インレットポートチューブの基部の周りに水滴を置き、デバイスのコーティングに使用したチューブを慎重に取り外します。ビオチン化粒子用チューブとPBS用チューブを各インレットポートに慎重に挿入します。

その後、ビオチン化粒子を毎分2.5マイクロリットルの流量で注入し始めます。顕微鏡のインレットポートを、粒子の最初の兆候で監視します。タイマーを開始し、フローを 3 分間続けます。

3分の終わりに、ビオチン化粒子の流れを止めると同時に、毎分2.5マイクロリットルの流量でPBSの流れを開始します。PBSをデバイス内に3分間流して、未結合の粒子を洗い流します。取得を開始するには、イメージングソフトウェアのスキャンラージイメージ機能を使用してデバイス全体の画像を取得し、次に順番にデバイス内の分岐部に番号を付け、チャネルの直径の2倍の円形の関心領域を作成します。

この場合、チャネルの直径は 100 ミクロンであるため、対象領域の直径を 200 ミクロンに設定します。イメージングソフトウェアの自動カウント機能を使用して、各関心領域の粒子数をスプレッドシートにエクスポートします。同様に、自動アカウント機能を使用して、デバイス全体のパーティクルの数をエクスポートします。

CFDシミュレーションが実行され、その結果はさらに解析するためにデータベースに保存されます。結果に含まれる情報には、壁面せん断速度、速度粒子束、およびデバイスへの付着性が含まれます。ここでの情報は、粒子濃度の定義された入力が与えられた場合に、各対象領域に付着する粒子の数を決定するために使用されます。

せん断接着マップを生成するには、最終ステップとしてテキストプロトコルに詳述されているように、接着率を計算します。ネットワークの各分岐部でのシアー レートと接着率の値を使用して、シアー接着マップをプロットします。この画像は、2ミクロンのビオチン化粒子が結合した後の典型的なアビダン被覆syn vivo SMNデバイスを示しています。

パーティクルは、ネットワーク内の分岐点の近くに優先的に付着することに注意してください。syn vivo SMNネットワークの番号付き分岐部はここで見ることができます。この画像は、デバイスのCFDモデルによって生成された壁面せん断マップのサンプルです。

せん断速度は、in vivoの微小血管系で観察されるように、250逆秒から15逆秒の範囲の範囲でデバイス内で変化します。これらの変動するせん断速度は、各流量に対して一定のせん断速度を提供するため、線形マイクロ流体チャネルで同時に取得することはできないことに注意してください。ここに示されている、ネットワークの各分岐点でのせん断速度の値のプロットは、せん断速度パターンが複雑であり、線形流路とは異なり、単純な解析関係では取得できないことを示しています。

さらに、ネットワークには複数の分岐が存在し、それらは同じシアービンに分類されます。表示されているデータの統計的信頼性を高めます。以下は、実験ネットワークの分岐と分岐の粒子フラックスを計算するために使用される、ネットワーク内の粒子フラックスのCFD解析のサンプル結果です。

単一のsyn vivo SMN実験から計算されたシアー接着マップは、線形チャネル実験から得られたシアー接着マップから観察された逆の関係に従います。ただし、SynVivoアッセイを使用すると、1回の実験でこの純粋なマップを生成できますが、複数の実験実行は線形チャネルから取得されます。このビデオを見れば、SynVivo SMNデバイスを使用して1回の実験から共有接着を生成する方法について十分に理解できるはずです。

この実験を行う際には、開発後にSynVivo SMNマイクロ流体デバイスに気泡を導入しないように注意することが重要です。この技術は、炎症分野の研究者が、1回の実験で白血球内皮の相互作用を異なる速度で研究する道を開きました。次世代のデバイスでは、研究者は白血球のローリング接着と移動を1回のアッセイで研究することができますが、これは現在不可能なことです。

この手順に続いて、薬物、薬物送達媒体、および細胞の接着を調査する他の方法を実施して、細胞細胞、細胞薬物および薬物媒体の接着に対する流れの生理学的影響などの問題を調査することができます。