組織工学：層状細胞シートの送達のための多細胞3D足場の構築

この手順の全体的な目標は、細胞シートを使用して組織改変パッチを構築することです。これは、まず細胞培養表面を感熱性ポリマーポリプロピルアクリルアミド(p nipamとも呼ばれる)で処理することによって達成されます。第2のステップは、ポリマーコーティングされた表面で目的の細胞を高密度に培養し、細胞シートを作成することです。

次に、プレートの温度を下げることでシートを持ち上げることで、細胞が細胞のシートとしてプレートから分離します。最後のステップは、無傷の細胞シートを移植用のコンストラクトに引き裂くことなく移動させることです。最終的には、単純な光学顕微鏡を使用して、細胞シートが操作中に作成および維持され、埋め込み型組織工学材料が作成されていることを示すことができます。

この技術の主な利点は、ヒドロゲルのように細胞をマトリックスに埋め込む既存の方法よりも、この技術では、細胞の横方向の境界を生成し、機能組織として維持できることです。これらの方法は、組織工学の分野でのさらなる研究も可能にします。例えば、移植後の細胞は、この組織化された状態にあるとき、どの程度生存できるのでしょうか?

この手順を実演するのは、私の研究室のポスドク研究員であるウィリアム・ターナー博士とスナップショット・サンドさんです。この手順を開始するには、2.6グラムのPニパムを2ミリリットルの60%トルエン、40%ヘキサン溶液に溶解します。次に、混合物を摂氏60度に10分間加熱し、Pニパムが溶解するまで攪拌します。

次に、濾紙を直径60mmの円に切り、ブフナーファンネルに入れます。ブフナー漏斗を通して溶液をろ過し、事前に計量したガラスビーカーに入れます。ビーカーと中身をベル掃除機で一晩保管します。

その後、ビーカーをニパムで計量します。続いて、イソプロピルアルコールをP nipamに加えて、50 50重量重量溶液を作成します。次に、2ミリリットルの溶液を組織培養プレートの表面に置き、UV光で5分間コーティングします。

次に、プレートを2ミリリットルの温かいPBSで2回洗浄してから、細胞培養に使用します。この手順では、まず、ラット大動脈平滑筋細胞を2ミリリットルの温かいPBSで洗浄することにより、ラット大動脈平滑筋細胞を分離します。次に、3ミリリットルのトリプシンまたは別の切断解離溶液を細胞に加え、5分間インキュベートします。

次に、3ミリリットルの培養培地または10%FBSを含むPBSを細胞に加えます。その後、円錐形のチューブに細胞を集めて数えます。その後、細胞を1000RPMで5分間回転させます。

上清を吸引し、細胞を増殖培地に再懸濁します。次に、細胞を含む培地を35 mmの感温プレートに100%のコンフルエンスを達成する濃度で置き、摂氏37度で一晩インキュベートして、プレートへの細胞接着を維持します。次に、内皮細胞を採取し、それらを単一細胞溶液に分散させます。

1 x トリプシンを使用すると、acuate バッファーまたは細胞解離バッファーをシングルセル分散にも使用できます。次に、同量の大豆トリプシン阻害剤またはPBS中の10%FBSでトリプシン酵素を不活性化します。次に、細胞を15ミリリットルの円錐管に集めます。

ヘモサイトメーターで細胞を数え、4mmパッチのパッチ寸法に必要な体積を計算し、その後200万個の内皮細胞を使用し、200万個の細胞を抽出して新しい15ミリリットルの円錐管に入れます。次に、細胞を5分間遠心分離し、上清を吸引し、細胞を円錐管内にペレットとして残します。次に、会社のプロトコルに従って高オーリンヒドロゲルを調製します。

高オーリンと液体ゼラチンを1対1の比率で混合します。続いて、ペレットを含む円錐管に全最終体積の80%を移し、高オーリンゼラチン混合物に内皮細胞を再懸濁します。次に、懸濁した細胞を線維性マトリックスに移します。

架橋剤の全最終容量の20%を添加し、摂氏37度で1時間インキュベートします。このステップでは、細胞が入った35mmのP nypa処理プレートをインキュベーターから取り出し、細胞培養フードに入れます。室温で、細胞から培地を迅速に吸引します。

それからゼラチンがまだ暖かい間皿に37の摂氏温度、6%の正常なゼラチンの2ミリリットルを加えて下さい、正常なゼラチンの表面の下にそれを沈めて、ゼラチンに金属格子を置きます。その後、プレート全体を氷の上に5〜7分間置き、ゼラチンを固めます。7分後、へらを使用して、ゼラチンの端をプレートの側面から慎重に分離します。

次に、鉗子で金属格子をプレートから持ち上げます。細胞シートをディッシュに移し、繊維状マトリックスハイドロゲルの組み合わせの上に置きます。2ミリリットルの37°C培地を組織培養プレートに加え、細胞のシートがヒドロゲル表面に付着するまで一晩インキュベートします。

その間に、溶液が温まったら金属格子を取り外してください。ここでは、細胞をPippaコーティングされた表面で培養し、次いでシート状に繊維状マトリックスの表面に移動させた。ゼラチン金属格子で転写されなかった初期の試験では、小さなボロボロのパッチが生じました。

この画像は、mito tracker、赤く染められたラット大動脈平滑筋細胞、カルシウムam緑色蛍光ヒト臍帯静脈内皮細胞、および透過光画像を組み合わせた初期のパッチデザイン合成画像を表しています。そして、これは細胞シートとより強力な塩基性繊維状マトリックスハイドロゲルの組み合わせを組み合わせた複合材料です。この合成画像は、パッチの底部からより強力な塩基性線維性マトリックスを介して撮影され、細胞シートのこの合成画像は、塩基性線維性マトリックス上で撮影されました。

シート内のハイドロゲルコンビネーション細胞は、細胞のバンチングにより端部で蛍光が増加した塩基性繊維マトリックスハイドロゲルコンビネーションを覆っています。これはコンストラクトの透過画像であり、DPI中の自己蛍光天然繊維塩基マトリックスがここに示されている。この手順に従うと、他の組織工学実験は、細胞のアライメントとコミュニケーションが移植の成功にどのように影響するかなど、他の質問に答えることができます。

この技術により、組織工学の研究者は、複数の細胞タイプを移植する複雑な方法を探求することができます。溶剤の取り扱いは非常に危険であることを忘れないでください。この手順を実行するときは、適切なマスクや化学フードの着用などの予防措置を常に講じる必要があります。