光活性化単一分子追跡を使用してライブ細菌細胞におけるタンパク質-DNA相互作用を可視化する

この手順の全体的な目標は、生きた細菌細胞内のDNA結合タンパク質の活性を直接視覚化し、定量化することです。これは、目的のDNA結合タンパク質に融合した光活性化蛍光タンパク質を発現する細胞を視覚化することによって達成されます。手順の2番目のステップは、イメージング中に個々のタンパク質が光活性化される動画を取得することです。

次に、データを分析してタンパク質の局在を特定し、単一細胞内のタンパク質を追跡します。DNA結合イベントは、単一のタンパク質が染色体に接触したときの拡散係数の変化によって識別されます。最終的に、その結果は、細胞あたりの結合タンパク質と拡散タンパク質の数をカウントすることにより、単一細胞レベルでのタンパク質DNA相互作用の定量的測定を提供できます。

この方法は、in vivoの修復率や修復部位の空間分布など、DNA修復分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。次に、DNAポリメラーゼの修復活性を測定することにより、その方法を実演します 生命で1つの大腸菌細胞 まず、摂氏500度の炉で1時間、バックグラウンド蛍光粒子のないカバースリップを作成します。厚さ1.5のカバースリップのストックサプライを燃やし、アルミホイルで室温で保管します。

今後数週間は使えるよ。次に、初期指数相大腸菌のミリリットルを株の1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに濃縮します。AB 1157 poly a PA m チェリーは、細胞を 2, 300 G で 5 分間遠心分離します。

上清を取り除き、細胞ペレットを20マイクロリットルの残留培地に再懸濁し、細胞を溶液にボルテックスします。次に、蒸留水で1.5%の低蛍光aros溶液を作ります。メルトしたエアロス500マイクロリットルと2 x 最小培地500マイクロリットルを混合し、メタンスルホン酸メチルまたはMMSを使用したDNA損傷実験のために数回静かにピペッティングします。

500マイクロリットルの最小限の媒体に8.3マイクロリットルのMMSを加えてから、混合物が冷える前にアロスと混合します。焦げたカバースリップに広げます。泡を作らずに均等に中央に広げます。

2枚目の焼けたカバースリップでパッドを平らにします。冷めたら、パッドからトップカバーを取り外し、濃縮細胞懸濁液のマイクロリットルを追加します。パッドを新しい焼けたカバースリップで覆い、非常に穏やかに押し下げて、細胞を固定します。

細胞は、乾燥する前の45分以内に画像化する必要があります。この時間を延長するために、DNA損傷実験のためにパッドをシリコンガスケット内に密封することができます。イメージングする前に、細胞をパッド上で20分間インキュベートします。

室温の加湿容器に入った顕微鏡には、405ナノメートルの光活性化レーザーと561ナノメートルの励起レーザーが使用されています。1分子感度は、高度に傾斜した照明を使用してカバースリップ表面上の薄いセクション内のフルオロ4のみを励起することにより達成され、蛍光発光は電子増倍CCDカメラに記録されます。サンプルを顕微鏡ステージに置き、細胞に焦点を合わせます。

透過光照明下では、クロップされた視野を定義して、データサイズを縮小し、カメラの読み取り速度を上げます。サンプルを周囲光から覆い、電子増倍CCDカメラゲインをオンにして、シングルフルオロ4を検出します。フレーム レートを 15.26 ミリ秒/フレームに設定します。

これには、0.26ミリ秒のカメラ読み出しが含まれます 時間露光時間は、動きがほとんど鳴り響かずに鋭い蛍光スポットを観察するために十分に短くする必要があります。一方、トラックは、結合した分子と拡散する分子を明確に区別するために、十分に長い時間間隔でサンプリングする必要があります。次に、カメラデータを表示して、暗い背景信号を確認します。

561ナノメートルレーザーのスイッチを入れ、励起バックグラウンド信号を確認します。Paul one PA M cherry 融合タンパク質の光活性化のために 405 ナノメートル レーザーのスイッチを入れ、単一分子の蛍光スポットが現れるまで強度を上げます。次に、励起ビームの角度を調整して、サンプルの薄い部分のみを照らします。

カバーの滑り面を閉じます。この方法は、単一の蛍光タンパク質の検出と正確な局在に依存しているため、顕微鏡の最適なアライメントと感度がデータ品質にとって重要になります。このためには、レーザービームを100 x 開口数1.4対物レンズの後焦点面に集束させます。

集光レンズをビームに対して垂直に平行に移動すると、焦点が対物レンズの中心から離れ、ビームが斜めに対物レンズから出ます。蛍光強度を最大にし、バックグラウンドを最小にするビームを目指してください。透過光顕微鏡モードで細胞の新しい視野を見つけ、画像の焦点を合わせます。

カメラのスナップショットを撮って、セルのアウトラインを記録します。561ナノメートルレーザーのスイッチを入れ、カバー上の細胞自家蛍光と背景スポットを漂白します。数秒間滑ります。

データ取得を開始する前に、561ナノメートルの連続励起下で手のひら動画の収集を開始してください。405ナノメートルのレーザーをオンにし、映画の過程で強度を徐々に増やし、1平方センチメートルあたり最大1ワットに達します。細胞の自家蛍光を引き起こす405ナノメートルの強度は避けてください。

蛍光分子の密度に注意してください。蛍光スポットが各フレームで明確に分離されるように、活性化率を低く保つことが重要です。映画ごとに約10, 000フレームを記録し、トリミングされた視野では、通常、最大3分、最大1ギガバイトのハードディスクスペースが必要です。

視野が画像化されると、pa m cherry fluorophores は不可逆的に漂白され、観察できないことに注意してください。繰り返しになりますが、次の手順では MATLAB のカスタム ソフトウェアを使用します。単一の蛍光色素は、点像分布関数(psfs)として現れます。

この動画では、バックグラウンドの標準偏差の4.5倍のピークピクセル強度を持つP SFSに対応する候補位置を持つ7ピクセル径のガウスカーネルを使用して、バンドパスフィルタリングされた画像でpsfsが最初に識別されます。候補 PSF あたりの局所的に明るいピクセルは、楕円ガウス関数を近似するための初期推定値として機能します。フリーフィットパラメータは、X位置y、位置X幅、Y幅回転、角度、振幅、および背景オフセットです。

楕円形のガウス マスクは、露光時間中の分子の動きを説明し、PSF プロットをぼかして変形させます。手のひらの動画のすべてのフレームから、Paul one PAM Cherryの同じ視野のローカリゼーションの透過光顕微鏡画像に結果として生じるXY局在化は、大腸菌細胞の中央領域内に現れるはずです。自動追跡はタンパク質の動きを測定しますが、追跡ウィンドウをうまく選択することが重要です。

まず、追跡ウィンドウ パラメーターの範囲に対して追跡アルゴリズムを実行します。セルあたりの測定されたトラックの数とトラッキングウィンドウをプロットして、同じ視野の透過光顕微鏡画像に結果のトラックを表示するトラックを分割しない可能な限り最小のトラッキングウィンドウを特定します。細胞内の分子移動の空間分布を視覚化するために、P one tracksは、トラックの一部が細胞間を横切っているように見える場合、単一の細胞内に閉じ込められた拡散を表示する必要があります。これは、トラッキングウィンドウが大きすぎたり、写真の活性化率が高すぎたりするために、別々の分子が誤ってリンクされていることを示唆しています。

連続するローカリゼーション間のステップ長の累積分布をプロットします。曲線は、十分に大きいトラッキング ウィンドウではスムーズに上昇して飽和しますが、ウィンドウが小さすぎるとカットオフ エッジが表示されます。適切なトラッキングウィンドウを選択すると、Paul Oneの拡散特性を分析できます。

各トラックの連続する位置推定間の平均二乗変位 (MSD) を合計 n ステップで計算し、少なくとも 5 つの位置推定を持つトラックのみを使用して、MSD の統計的不確実性を減らします。次に、MSDからトラックあたりの見かけの拡散係数を計算します。2 番目の項は、推定されたローカリゼーション誤差を補正します。

これらは 2 番目の項の値です。この例では、損傷を受けていない細胞のpol oneとMMSによるDNA損傷処理下の細胞のpol oneの視野内のすべてのトラックから測定された拡散係数値のヒストグラムをプロットすると、赤いバーは染色体に結合して現れ、毎秒0.15平方ミクロン未満で拡散する個々のpol one分子の集団を識別します。一方、自由に拡散する分子は、毎秒約0.9平方ミクロンで移動します。

結合したポール1分子が同定された後。結合部位の位置は、損傷を受けていない細胞とmmMS損傷のある細胞で視覚化できます。観察されたトラックの総数に対する結合したトラックの割合は、polのDNA修復活性の直接的な定量的尺度を提供します。

pol one PA m チェリー融合タンパク質の in vivo 光活性化を、生きた大腸菌細胞で行いました。光の活性化は、1つの細胞内の単一のPA mチェリー蛍光色素に限定することができ、光の活性化率が高いほど、より多くの蛍光分子が明らかになりました。ローカリゼーション分析は、手のひらムービーの各フレームに対して実行されました。

固定細胞内の不動分子または生細胞内の結合分子を用いて精度を測定したところ、理論予測と一致する40ナノメートルであることがわかった。次に、ローカライゼーションのしきい値が低すぎる場合に設定します。バックグラウンドノイズのランダムなピークが誤って候補位置として選択されましたが、しきい値が高すぎると、一部のスポットが見落とされました。

結果として得られたポールワンの局在化は、細胞の中央領域を占め、大腸菌の核様体の空間的構成を広く再現しました。ポールワンの大部分は、損傷を受けていない細胞で拡散を示します。典型的な細胞は、大腸菌細胞あたり約400ポール1分子のコピー数と一致する数百のポール1トラックを含む。

さまざまなタイプの分子運動は、指向性運動が放物線曲線を与える遅延時間の範囲にわたってMSD値を計算することによって識別できます。ブラウン運動は直線によって特徴付けられます。閉じ込められた拡散曲線はプラトーに達し、不動粒子のMSD曲線のオフセットは局在化の不確かさを表します。

結果として得られたポールワンのMSD曲線は、ブラウン運動を示す短いラグタイムで直線的に上昇し、セルの閉じ込めにより長いラグタイムで飽和しました。これらの方法を用いて、ポールのDNA修復活性は、損傷を受けていない細胞における外因性DNAアルキル化損傷に応答して1つ測定した。ポールの拡散係数ヒストグラムは、拡散する分子の支配的な集団を示しています。

この数少ない結合分子は、100ミリモルのMMS損傷が連続して発生すると、DNAの複製や内因性DNA損傷の修復に関与する可能性がある。拡散係数がゼロに近いトラックの周波数は大幅に増加します。これは、この手順に続いて、より多くのポール1分子がDNA修復に関与しなければならないというモデルを支持しています。

ローカリゼーション、クラスタリングなどの他のデータ分析方法を実行して、細胞内のタンパク質の空間分布を定量化し、DNA修復に関与するより大きなタンパク質複合体の存在を調査することができます。