ペプチドを結合蛍光タンパク質のDNAを用いた表面係留大型DNA分子の可視化
2016年6月23日
ポリエチレングリコール(PEG)とアビジンコーティングされたガラス表面につながれ、マイクロ流体のせん断流で引き伸ばされた蛍光タンパク質DNA結合ペプチド(FP-DBP)で染色された大きなDNA分子を視覚化するアプローチを提示します。
この手順の全体的な目標は、エピ蛍光顕微鏡用の便利なDNA分析システムを作成し、改質ガラス表面上の単一分子DNAを操作することです。この方法は、DNA可視化分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。DNA自己、DNA結合タンパク質、その他の小分子を調べるとき。
この技術の主な利点は、移動するDNAを簡単に観察および分析できることです。まず、ガラスのカバースリップをPTFEラックに置き、PTFEスレッドシールテープを使用して所定の位置に固定します。カバースリップを包んだ後、クリーニング手順中にラックの取り扱いに使用する長さ5センチのテープを残しておきます。
ドラフトで、350ミリリットルの硫酸と150ミリリットルの過酸化水素を1リットルのガラスビーカーに混ぜ合わせて、ピラニアエッチング溶液を作ります。次に、カバースリップのラックを溶液に入れます。2時間後、ビーカーを空にし、カバーガラスを脱イオン水で十分にすすいでください。
ビーカー内の水のPHが中性のPHに達するまで、カバーガラスをすすぎ続けます。次に、カバースリップのラックをビーカーで30分間超音波処理し、ガラス基板を洗浄して誘導体化します。アミノシラン化の直前に、ビーカーから空の水。まず、清潔なポリプロピレン容器に2ミリリットルのアルコキシシランと10ミリリットルの氷酢酸を200ミリリットルのメチルアルコールに加えて、アミノシラン化溶液を調製します。
続いて、きれいなカバースリップを溶液に入れます。次に、洗浄したカバースリップを調製した溶液に入れ、室温で100rpmで30分間振とうします。次に、誘導体化されたカバースリップで容器を75ワットで15分間超音波処理します。
その後、室温で100rpm以上再度振とうします。終了したら、ビーカーから溶液を空にし、カバースリップを3回注意深くすすぎます。1回はメチルアルコール、2回はエチルアルコールです。
最終すすぎ後、カバーガラスをエチルアルコールで保管し、2週間以内に使用してください。まず、0.1モルの重曹溶液を10ミリリットル作り、0.22ミクロンのシリンジフィルターでろ過します。次に、2ミリグラムのビオチンPEGスクシンイミジルカーボネートと80ミリグラムのPEGスクシンイミジル吉草酸エステルを350マイクロリットルのろ過重炭酸ナトリウム溶液に溶解します。
光保護チューブを使用して溶液を光から保護します。チューブを10秒間激しく渦巻き、次に10、000 x gで1分間遠心分離して気泡を取り除きます。次に、スライドガラスをアセトンですすぎ、続いてエチルアルコールですすいでください。
すすぎたら、スライドを完全に風乾させます。50マイクロリットルのPEG溶液を清潔なスライドガラスの上に置きます。アミノシラン化カバースリップをわずかな角度で液滴上にゆっくりと下げて、カバースリップの下に気泡が発生しないようにします。
次に、スライドを室温で少なくとも3時間から一晩、水平で暗く加湿されたチャンバーに入れます。終了したら、残留PEG溶液を光保護チューブに密封し、摂氏4度に保ちます。インキュベーション後、PEG化カバースリップを脱イオン水で十分にすすぎ、使用するまで暗く乾燥した場所に保管します。
フローチャンバーを作成するには、アクリルホルダーに両面粘着テープストリップを置き、入口と出口の穴に対して垂直に位置合わせされ、チャネル穴を乱さないようにします。次に、ピペットチップを使用してテープをこすり、チャネルをシールします。次に、PEG化した面を下にして、PEG化カバースリップをテープの上部に置き、フローチャンバーを作成します。
溶液が漏れないように、両面テープが貼られている領域にカバースリップの上部を押し付けます。次に、速乾性のエポキシ接着剤をチャンバーの端に追加して、所定の位置に固定します。次に、長さ2.5センチメートルのチューブを気密シリンジに接続し、ジョイントをエポキシ接着剤でシールします。
次に、長くて柔軟なチューブをシリンジからのチューブに接続します。そして再び、エポキシ接着剤でジョイントをシールします。シリンジにつながれているチューブに脱イオン水を入れ、気泡がないことを確認します。
次に、エポキシ接着剤で密封されているフローチャンバーの穴にチューブを挿入します。そして、200マイクロリットルのピペットチップをもう一方の穴に置き、リザーバーとして使用します。シリンジポンプの流量を毎分50マイクロリットルに設定します。
次に、20マイクロリットルのアビジンタンパク質溶液をチャンバーに流し、10分間そのままにします。次に、20マイクロリットルのビオチン化オリゴデオキシヌクレオチドをシリンジにロードします。それをチャンバーに流し込み、10分間そのままにしておきます。
末端トランスフェラーゼを使用する場合は、オリゴデオキシヌクレオチドのローディングをスキップしてください。次に、20マイクロリットルのDNA溶液を注射器にロードし、毎分10マイクロリットルの速度でチャンバーに流し込み、30分間そこに保持します。30分間のインキュベーション後、フローチャンバーを40マイクロリットルの1X TEバッファーで毎分50マイクロリットルで洗浄します。
洗浄したら、同じFP-DBPを80ナノモルの濃度で40マイクロリットルをチャンバーにロードし、1X TE.To でDNA分子の全ストレッチ範囲を確認し、使用するDNAの長さに応じて異なる流量を適用します。蛍光顕微鏡を使用して、60倍の対物レンズの下でDNAを観察します。これは、表面につながれたバクテリオファージのラムダDNA分子が、ビオチン化相補型オリゴヌクレオチドによるライゲーション後の流れによって引き伸ばされる様子を撮影した蛍光顕微鏡ビデオです。
フロー下では、完全に細長いDNA分子の長さは16.5ミクロンです。対照的に、バクテリオファージT4 DNAモムレキュールは、フロー下で56.4ミクロンの長さに伸びています。この伸長は可逆的であり、DNAは複数回伸ばしたり弛緩させたりすることができます。
このビデオを見れば、FP-DBPを大規模DNA解析で使用する方法や、DNAポリマーの伸縮性と緩和性を実証する方法を十分に理解できるはずです。
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概要
本記事では、蛍光タンパク質DNA結合ペプチド（FP-DBP）で染色した巨大DNA分子を可視化する方法を紹介します。この手法では、ポリエチレングリコール（PEG）およびアビジンでコーティングしたガラス表面にこれらの分子を係留し、マイクロ流体せん断流を用いて伸展させます。
研究の主要構成要素
科学分野
- DNA可視化
- 蛍光顕微鏡法
- 単一分子操作
背景
- 本研究では、DNAおよびDNA結合タンパク質の解析に焦点を当てています。
- DNA解析システムの利便性の向上を目的としています。
- 本手法により、移動するDNAの観察が可能になります。
- エピ蛍光顕微鏡での使用を想定して設計されています。
研究目的
- 単一分子DNAを操作するためのシステムを開発すること。
- DNAおよび関連タンパク質の可視化を向上させること。
- DNAダイナミクスの解析を容易にすること。
使用した手法
- PTFEラック上でのガラスカバースリップの準備。
- PTFE製ネジシールテープによるカバースリップの固定。
- 修飾されたガラス表面の洗浄手順。
- DNA伸展のためのマイクロ流体せん断流の利用。
主な結果
- 修飾表面への巨大DNA分子のテザリングに成功した。
- FP-DBP染色を用いたDNAダイナミクスの効果的な可視化を実現した。
- 移動するDNAをリアルタイムで解析する能力を向上させた。
- DNA研究における本手法の有用性を実証した。
結論
- この手法は、DNA可視化への新しいアプローチを提供します。
- DNAと結合タンパク質との相互作用に関する知見が得られます。
- 本手法は、分子生物学分野の研究を推進させることができます。
よくある質問
産業界における重要性
蛍光タンパク質DNA結合ペプチド（FP-DBP）を用いて表面に係留された巨大DNA分子を直接可視化することで、単一分子レベルでDNA-タンパク質相互作用を精密に解析することが可能になります。この手法は、バイオ医薬品の創薬パイプラインにおける初期段階のターゲットバリデーションおよびメカニズムのリスク低減に寄与します。また、後続のアッセイ開発やスクリーニングワークフローにおける予測精度の向上を実現します。
バイオ製薬R&Dにおける戦略的活用
初期創薬探索およびターゲットバリデーション
- DNAとタンパク質の結合イベントを直接観察でき、メカニズムの解明が可能になります。
- 制御された環境下で、DNA結合ターゲットの機能的な検証をサポートします。
- 疾患パスウェイに関連する分子相互作用について、仮説に基づいた解析を容易にします。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- ハイコンテンツアッセイに向けた、バリデーション済みのDNA基質を調製するための再現性のあるプラットフォームを提供します。
- 定義された条件下でのDNAの伸展および弛緩の定量的な測定を可能にします。
- DNA-タンパク質相互作用を標的とした化合物スクリーニングにおける標準化とスケールアップをサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 単一分子レベルでDNA-タンパク質のダイナミクスをモデル化することにより、疾患に関連するメカニズム研究と整合させることができます。
- DNA標的モダリティについて、創薬から前臨床検証までの継続的なフローを提供します。
- 初期段階のリスク評価における生物学的な曖昧さを低減します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、初期のメカニズム研究からアッセイ開発、前臨床研究に至るまでの創薬の連続的なプロセスに組み込まれ、リード化合物の同定およびターゲットのバリデーションを支援します。
- 探索生物学：DNA-タンパク質相互作用を可視化することで、仮説検証およびパスウェイの解明を可能にします。
- スクリーニング：定量的な読み取りが可能な、表面係留されたアッセイ準備済みのDNA基質を提供します。
- 分析：比較分析のために、DNAの伸長および緩和のリアルタイム測定を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：DNA-タンパク質相互作用が疾患に関連する場合、メカニズム的な知見を前臨床モデルの検証へと結びつけます。
- 企業における再利用：さまざまなプログラムにわたる多様なDNA結合タンパク質研究のための、再利用可能なプラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを軽減します。
- 運用上の価値： 再現性と拡張性を確保するため、DNA可視化ワークフローを標準化します。
- 戦略的価値： 初期段階の生物学的リスクを明確にすることで、go/no-go判断の質と資本効率を向上させます。
- ポートフォリオへの影響： リスク調整済みの優先順位付けを行い、DNA標的アセットの推進をサポートします。
実施上の検討事項
- 表面化学、マイクロフルイディクス、および蛍光顕微鏡法の専門知識が必要です。
- エピ蛍光顕微鏡およびマイクロフルイディクス流量制御システムへのアクセスが不可欠です。
- 表面調製およびDNA標識プロトコルのチーム間での標準化が必要です。
- 異なるDNA長や結合タンパク質クラスに応じて、最適化が必要になる場合があります。
- 信頼性の高い結果を得るためには、表面パッシベーションと非特異的結合の低減が極めて重要です。
