ギブソンアセンブリと遺伝子銃を用いてタバコの一過性の遺伝子発現

次の実験の全体的な目標は、タバコの葉の表皮細胞におけるA GFPタグ付きレポーターの一過性の遺伝子発現を観察することです。これは、まず葉緑体とペルオキシソームで発現するDNAコンストラクトを設計することによって達成されます。次に、コンストラクトをPCR増幅とギブソンアセンブリを使用して構築します。

次に、遺伝子銃を使用して、コンストラクトをタバコの葉の表皮細胞に送達します。最終的に、共焦点顕微鏡によるタバコの葉のイメージングにより、葉緑体とペルオキシソームでのGFP発現が明らかになります。この手法が従来のクローニングなどの既存の方法と比較した場合の主な利点は、制限酵素を必要としないため、PCRによって増幅できる任意の配列をクローニングできることです。

遺伝的デザインの柔軟性により、これらの技術の応用はより大きなスケールにまで及びます。農業植物の遺伝子工学 このプロトコルは、最終的なタンパク質発現のための植物細胞内の部位を決定することから始めます。この研究では、葉緑体、ペルオキシソーム、およびサイトゾルに発現を標的とすることを目指しています。

次に、式コンストラクトを設計します。コンストラクトは、単一のプラスミド内にプロモーター、検出可能な遺伝子、およびターミネーターを含まなければなりません。この場合、構成プロモーターPエンドカップ2がGFPの発現を駆動し、その後にNolene Synthe、ターミネーターまたはnos tが続きます。

この実験では、葉緑体およびペルオキシソームでの発現について、一連のタグ、tritタグ、1つ、2つ、および3つの発現末端をGFPにテストすることに注意してください。ギブソン集合法は、既製の混合物中のいくつかの酵素の作用に依存して、二本鎖DNAの末端を部分的に消化し、隣接するDNA配列の相補的な塩基対のアニーリングを促進します。最終的なコンストラクトには3つの部分があり、Gibsonアセンブリの前に4回のPCR反応で増幅する必要があります。

1回目と2回目の反応は、GFP NOS TとCANY耐性マーカーを含む8, 000塩基対プラスミドベクターPOREを増幅します。耐性マーカーは、この大きなDNAをPCR増幅しやすい2つの小さなテンプレートに分割するのに適した場所です。第3の反応は、プロモーターPのエンドカップ2を増幅し、第4の反応は、類人猿の設計などのインシリコ設計ソフトウェアを用いてトライアグ1を増幅し、各ピース間に50塩基対が重なるように、塩基用コンストラクトベースとなる。

PCR用のプライマーをご注文の際は、50塩基対を重ねて各方向のプライマーとして25塩基対を各方向に用いることが可能であり、各成分を増幅するPCRを行った後、PCR産物を別々に精製し、蒸留脱イオン水で希釈する。PCRテンプレートが制限酵素DPNによる大腸菌治療からのミニプレップであった場合、汚染テンプレートDNAが除去されます。次に、各DNA断片の濃度を測定します。

組み立てる各コンストラクトについて、ベクター濃度をマイクロリットルあたり約150ナノグラムに調整し、コントロールを含め、ギブソンアセンブリミックスの15マイクロリットルのアリコートを冷凍庫から取り出し、氷上で解凍します。オンラインのオープンソースtool@gibbonを使用します。orgで、各フラグメントの等モル量の体積を決定します。

各フラグメントの計算容量を15マイクロリットルのギブソンミックスに加えます。また、ベクターDNAのみのコントロールを調製します。各反応の総容量は20マイクロリットルであるべきです。

必要に応じて水を使用して音量を調整します。チューブを摂氏50〜55度で30〜60分間インキュベートします。インキュベーション後、チューブを氷の上に戻します。

マイナス80°Cの冷凍庫から200マイクロリットルの塩化カルシウムコンピテント大腸菌の市販製剤が入ったマイクロフュージチューブを取り出し、手で少し温めます。次に、反応の20マイクロリットルすべてを大腸菌に加えます。培養物を氷上で30分間インキュベートし、摂氏42度の水浴に移し、60秒間熱ショックを与えます。

エレクトロコンピテントセルは使用しないでください。比較的高い塩濃度と低いDNA濃度は、形質転換後に細胞を弧を描く原因となる可能性があります。培養物をICEに2分間戻し、次に750マイクロリットルのSOCまたはLB培地を適用し、摂氏37度で30分間回復させます。

次のプレートでは、LBプレート上の混合物をCANYまたは他の適切な抗生物質とインキュベートし、シーケンシングにより摂氏37度で一晩で10コロニーをスクリーニングします。この方法では、従来のライゲーションベースのクローニングよりもバックグラウンドが高く、非標的組換えイベントの数が多くなる可能性があることに注意してください。遺伝子銃によるタバコの生物的トランスフェクションは、以前にJoVEで説明されています。

ここでは、主要な手順と以前のプロトコルとの違いを確認します。コンストラクトを増幅して単離した後、woodsとzetoによるJoVEの記事に記載されているように遺伝子銃弾を調製し、Nico Tania Benham Mianaタバコ葉表皮組織のトランスフェクションのために遺伝子銃にロードします。生後3〜5か月の植物の基部に近い大きな葉を選択してください。

適切な目と耳の保護具を着用して、15センチのペトリ皿に濡れたペーパータオルの上に下面を上にして慎重に置きます。遺伝子銃のヘリウム圧を200〜250PSに設定します。私は慎重に遺伝子銃を葉の下側の肋骨の間、その約3〜5センチ上に向けます。安全性を解除し、粒子を葉に届けます。

各弾丸をリーフの同じ場所で2回使用します。別の場所に移動し、リーフが爆発した場合はこのプロセスを繰り返し、廃棄して新しいリーフを開始します。葉の靭性には、年齢、水分などの成長条件により、多少のばらつきがあります。

すべてのショットが届けられたら、葉を覆い、ベンチの暗い場所で2〜3日間保管します。UV蛍光を施した解剖顕微鏡で葉を検査し、GFPを発現する個々の細胞を検索します。GFPを発現する細胞が見つかったら、解剖ハサミを使って葉の5〜10mm切片を丁寧に抽出します。

直ちに、0.1%Triton X 100の約200マイクロリットルを含む深井戸顕微鏡スライドのウェルに個々の葉片を沈めます。この洗剤は、表面に気泡が形成されるのを防ぐのに役立ち、ディープウェル顕微鏡スライドは、適切なフィルターと40 x 水浸対物レンズを備えた共焦点顕微鏡を使用して、より大きな組織イメージング領域の画像細胞を可能にします。この研究では、3つの異なるGFPオルガネラターゲティングコンストラクトを、アンタグGFPおよびルビスと比較しました。コアグ。

GFP共焦点顕微鏡法を用いて、タグなしGFPを発現させた対照実験において、一過性に形質転換した単一細胞のGFP蛍光を検出しました。蛍光は、核および細胞質においてのみ観察され、葉緑体では観察されず、葉緑体のみを有する細胞のこの例に見られるように、葉緑体の赤色自家蛍光によって同定される。GFPコンストラクトGFPは、大きな細胞小器官で発現しました。

セルは白で縁取られています。黄色は、コンストラクトとクロロフィルの共局在の領域を示しており、このトライアグの画像に示されているように、コンストラクトが葉緑体を標的としていることを示しています。これは、トランスフェクションされた細胞GFP発現が葉緑体、末梢、サイトゾル、およびペルオキシソームであると考えられている小さな点状のオルガネラに見られます。同様に、トランスフェクトされたtriag 2細胞は、葉緑体細胞質およびペルオキシソームtriag threeでもGFPを発現し、これは葉緑体配列の低複雑性領域に埋め込まれたペルオキシソームシグナルで構成され、葉緑体とペルオキシソームのみに局在します。

このセルは別の葉の層にあることに注意してください。この図は、典型的なタバコの葉の表皮細胞のコンパートメントで観察された発現をまとめたものです。細胞内の相対的なサイズと位置、および遺伝子銃トランスフェクションと共焦点顕微鏡法で観察された相対的な発現レベルが示されています。

タグなしGFPはサイトゾルと核に局在し、PIMT 2 GFPコントロールは葉緑体とトライアグ1 GFP、トライアグ2 GFP、トライアグ3G FPは予測どおりに葉緑体とペルオキシソームに局在することに注意してください。 このビデオを見た後、ギブソンアセンブリを使用してプラズマを構築する方法についてよく理解できるはずです。 タバコの葉にバリー状に送達し、3日以内にGFP発現を観察します。この手順を試みる際には、ギブソンアセンブリのためのベクターDNAのマイクロリットル当たり150ナノグラムを使用すること、およびあなたの遺伝子銃の弾丸を作るためにあなたの最終的なDNA構築物のマイクロリットル当たり1500ナノグラムを使用することを覚えておくことが重要ですこの手順に続いて、アグロバクテリウムトランスフェクションのような他の方法が、一過性ではなく安定した遺伝子発現を得るために行うことができる。