行動経験に続いて脳試料からの転写動態の網羅的解析

次の実験の全体的な目標は、行動経験後のマウスの転写ダイナミクスと定義された脳核を研究することです。これは、最初に動物を慣れさせ、生理食塩水注射後の自発運動活動を記録することによって達成されます。一度慣れると、コカインの単回投与後に自発運動活動が記録され、側坐核からのサンプルが収集され、RNA単離とCDNA調製に使用されます。

次に、行動によって誘発される遺伝子発現を研究するために、QPCR解析を行います。最終的に、コカイン体験後の転写動態を示す結果が得られます プロトコルを実証するのは、ラボマネージャーのハトゥ博士、ラボの大学院生であるダム・ミューア、ラボの学部生であるデュランが3日間連続で行います。各マウスは、実験を開始する前にマウスをケージに整理し、マウスをケージに整理し、取り扱いおよび注入手順に慣れているため、将来マウスがケージ間で移動することはなく、マウスが長期間隔離されたまま放置

試験開始の30分前に、動物が環境に順応できるように、すべての試験ケージを行動室に移す必要があります。注射の直後に250マイクロリットルの生理食塩水を腹腔内注射し、マウスを行動チャンバーに入れて自発運動活動を15分間監視します。マウスをビヘイビアチャンバーに20分間置くことができます。

2 分から 17 分まで監視されたアクティビティ。次の 2 日間、これらの手順を 1 日の同じ時間に繰り返します。4日目に、グループに応じて、コカインまたは生理食塩水の単回注射を投与し、すぐにマウスをチャンバーに入れて、コカイン曝露後の選択された時点での局所的な運動活動を20分間監視し、脳を抽出して氷冷し、CSF溶液を1〜2分間冷やして固めます。

小脳を取り除き、余分な水分を吸い取った後、吻側部分を上に向けて脳をビブラムのステージに接着します。チャンバーに氷冷したA CSFを充填し、側坐核が明確に識別されるまで200ミクロンの切片をスライスします。切断中は、脳梁の形状、前交連と心室の位置と形状に細心の注意を払ってください。

正しい領域が特定されたら、側坐核をステレオスコープで解剖する400ミクロンの2つのセクションをスライスします。細かい刃を使用して、側坐核をスライスから離剖します。ブレードを正しい領域に4回すばやくパスすると、適切な組織をすぐに分離する必要があります。

単離した組織を900マイクロリットルの溶解試薬に入れ、RNA抽出が始まるまでマイナス80°Cで保存し、チューブを37°Cで解凍して均質化します。25ゲージの針を使用すると、最初の数ラウンドは難しく、組織をチューブの壁に押し付けて組織を細かく均質化する必要があります。適切な均質化を確保するには、ライセートをkayaシュレッダーミニスピンカラムにピペットで移し、遠心分離します。

ライセートを新しいマイクロ遠心チューブにピペットで移し、製造元の指示に従ってRNAを抽出します。RNA精製に続いて、CDNAへの逆転写を行い、解析用に選択した遺伝子群に対するプライマーを用いたサンプルの標的特異的なプレエム増幅を行います。これらの手順は、プロトコルのテキストバージョンで説明されています。

包括的なQPCR解析用の市販のマイクロ流体チップは、48 x 48で入手できます。48個のプローブセットで48個のサンプルを分析できる形式、または96個のプローブで96個のサンプルを分析できる96 x 96形式のフォーマット。ほとんどの場合、チップの選択は主に分析するサンプルの数に依存します。

まず、実験用に選択したチップに従ってサンプルミックスを準備します。20 XDNA結合色素サンプルローディング試薬をピペッティングする際には注意してください。サンプルミックス溶液を最低20秒間撹拌し、少なくとも30秒間遠心分離します。

調製した反応は、チップがロードできるようになるまで、摂氏4度で短時間保存できます。次に、アッセイミックスを調製し、サンプルミックスを十分に撹拌し、遠心分離してすべての成分をスピンダウンします。先に示したように、ダイナミックアレイIFCチップには、サンプルとアッセイ用のインレットと、マイクロ流体チャンバーの加圧に使用される制御ライン流体用の指定されたインレットがあります。

まず、チップ上の各アキュムレータに制御ライン液を注入します。次に、チップをIFCコントローラーに配置し、適切なスクリプトを実行してプライミングします。スクリプトが終了したら、プライミングされたチップをIFCコントローラーから取り出し、各アッセイの5マイクロリットルをピペットで掴みます。

チップに混ぜます。各サンプルミックスの5マイクロリットルをインレットに加え、IFCコントローラーソフトウェアを使用してチップをIFCコントローラーに戻します。スクリプトを実行して、サンプルとアッセイをチップにロードします。

ロードミックススクリプトが終了したら、ロードされたチップをIFCコントローラーから取り外します。次に、サーマルサイクラーにチップをロードし、融解曲線解析を含む新しいチップランを作成します。サーマルサイクラーソフトウェアを使用すると、反応チャンバーが適切に認識され、反応が完了まで実行できるようになります。

自発運動活動の増加は、1回の急性コカイン注射後に明らかでした。この冠状切片では、側坐核の境界を定義するために行われた切り込みの位置を太い白い線で示しています。解剖中、CFOおよびphos Bに対するプライマーの増幅曲線は、プライマーペアが約100%の効率で標的転写産物を増幅することを示しています。

すべてのサイクルで、コカインは側坐核におけるCFOとphos Bの発現を誘導し、曝露後1時間と2時間後に最も高かったという結果が出ています。この手順に続いて、新しい未特徴の転写産物を同定するために、次世代シーケンシングなどの他の方法を実行できます。