前立腺細胞の方向性のある移動を研究するためにカスタム設計された電気走チェンバースを利用

この手順の全体的な目標は、印加電界中の細胞の方向性移動を評価するアッセイであるGalvan Axxisを実行することです。これは、最初にGalvan axxisチャンバーを組み立て、次に目的の細胞を播種することによって達成されます。2番目のステップでは、チャンバーを密閉し、タイムラプスイメージングのために電界を印加します。

最後のステップでは、個々のセルの移動速度と電界に対する角度を追跡します。最終的には連署します。を使用して、セルが電場にどのように応答するか、およびセルがカソードに方向に移動するかどうかを示すことができます。

この技術の主な利点は、二次分析のためにテキサスに投与した後の細胞回収が容易であることと、高倍率で蛍光標識細胞を使用して遊走を撮影することが容易であることです。この方法の視覚化は、チャンバーの組み立て手順をデモンストレーションなしでは習得するのが難しいため、この方法の視覚化は非常に重要です。プラスチック製のガルバンアクシスチャンバーを2つのプロパノールで拭くことから始めます。

次に、シリンジを使用して、チャンバーの底面にある円形の開口部の周りにマリングレードのシリコンシーラーを塗布します。シーラントの上に大きなカバーグラスを配置し、綿アプリケーターの端で所定の位置に押し込み、綿棒で余分な接着剤を拭き取ります。次に、ひし形のポイントマーカーを使用して小さなカバーガラスをカットし、6 x 25ミリメートルのスペースを作り、チャンバーを裏返します。

次に、シリンジを使用して2本のシリコンのストライプを塗布し、底面ガラスの2つの円形開口部の間にセル接着用の10 x 25 mmのチャネル表面を作成します。次に、円形の開口部の間に2つのガラススペースを接着し、新しい綿のアプリケーターでスペースを押し下げ、示したように余分な接着剤を拭き取ります。シリコーン接着剤が硬化するまで、チャンバーを24時間試してください。

翌日、チャンバーを蒸留水に一晩浸して接着剤から酢酸残留物を取り除き、細胞をチャンバーに播種します。先ほど示したように、チャンバーを2つのプロパノールで乾かして拭きます。滅菌PB S3で洗浄し、チャンバー内の2つの円形開口部間の液体の流れを確認します。

チャンバーが良好な状態にあることを確認した後、滅菌培養皿に包み、チャンバーを摂氏37度に15分間置きます。チャンバーが電子平衡化している間に、摂氏37度で5ミリリットルのトリプシンEDTAを使用して、前立腺細胞を培養皿から取り外します。5分後、5ミリリットルの10%FBSで反応を中和します。

PBSでは、分離した細胞を15ミリリットルのチューブに移し、5分間遠心分離します。200倍、Gで、培地を吸引し、次にペレットを1ミリリットルの培地に再懸濁します。次に、細胞をカウントした後、培地とシードを使用して細胞濃度を1ミリリットルあたり4細胞に8×10に調整します。

各チャンバーに350マイクロリットルの細胞懸濁液。細胞をチャンバー内で一晩、37°Cと5%の二酸化炭素で濡れたKimワイプを塗布した培養皿でインキュベートします。翌日、まず各ガルバンAXSチャンバーについて摂氏37度までの10ミリリットルの培養物を温めることにより、上部チャンバーの組み立てを開始します。

培地が温まっている間に、インキュベーターからGalvan axxisチャンバーを摂氏37度の温熱プレートに移し、チャンバーを培地ですすいでください。付着していない細胞を除去するには、チャンバー内に400マイクロリットルの培地を残し、シリンジを使用して両方のガラススペースの上に高真空グリースを塗布します。カバーガラスと綿のアプリケーターでチャンバーを密封し、ガラス表面を乾燥させます。

次に、高真空グリースをシリンジで塗布し、カバーガラスとチャンバーの隙間を塞ぎます。次に、培地を内側のリザーバーに加えます。気泡を取り除き、リザーバー間の液体の流れを確認します。

寒天ブリッジに2インチのPVCチューブを一対切断するには、それらを裏返してから、ピースを100ミリリットルのビーカーに入れます。次に、200ミリグラムのバクトトゥ寒天培地を50ミリリットルのフラスコに加え、10ミリリットルの培地で2%寒天ゲルを作ります。30秒間電子レンジで加熱した後、トランスファーピペットを使用して寒天ゲルをプラスチックチューブにロードし、寒天ブリッジを室温で10分間放置して寒天を固めます。

次に、ギャルチャンバーの外側のリザーバーに2ミリリットルの培養液を追加し、寒天ブリッジを内側と外側の培地リザーバーに挿入して電流を流し、移動のタイムラプスイメージングを実行します。まず、ガルバンチャンバーを顕微鏡ステージ上の摂氏37度の環境チャンバーに移し、チャンバーをテープで固定し、10倍の対物レンズの下の細胞に焦点を合わせます。次に、ガルバンAxxis電極を右側にカソードを外側のリザーバーに挿入し、ワイヤーと電極をテープで固定します。

次に、電源ボックスのスイッチを入れてチャンバーに電界を印加し、電圧計を使用してチャンバー全体の出力電圧を測定し、長さ25ミリメートルのチャンバーで2.5ボルトに達します。次に、チャンバー全体で10ポイントを選択して10本のタイムラプス動画を生成し、取得条件を10分間隔で2時間に設定します。その後、撮影を開始し、必要に応じて出力電流を調整して、実験中の電界強度を維持します。

実験の最後に、チャンバーをステージから取り外し、細胞を95%アルコールに固定します。次に、チャンバーを壊して開きます。カバースリップは後で使用するために保存できます。

染色とイメージング。将来の年のためにチャンバーを清掃します。Galvan Axxisを定量化するには、タイムラプス動画を回転させて、カソードを画像の上部に向けます。

セルトラッキングソフトウェアにムービーをエクスポートし、各ムービーから各時点における10〜20セルのXY位置を手動で追跡し、南北方向に対する移動距離と角度、セルトラッキングソフトウェアで電界の同じ向きが計算されます。最後に、測定値を保存し、データをデータベースアプリケーションにインポートして、結合された結果を計算します。この代表的なGalvan Axxis実験では、前立腺細胞の系統に、2時間にわたって同様の速度で移動することが決定されました。

しかし、電界に対する方向性は、PRNS one one lineで0.7プラスマイナス0.3、PNT two lineで0.2プラスマイナス0.8であり、これら2つの細胞株のガルバン軸に有意な差があることを示しており、それらの細胞シグナル伝達メカニズムが電界に対する直接的な異なる移動応答を示唆している。この技術は、研究者がエレクトロフィールドにおける細胞の方向性移動のメカニズムを探求するのに役立ちます。