外部から印加された直流電界における神経前駆細胞の移行動態の解析のための走電性アッセイ

本手順の目的は、直流電場存在下における成体由来神経前駆細胞の遊走を可視化することです。まず、成体マウスから脳室下帯神経前駆細胞を単離して培養します。次に、Galvan Axxisチャンバーを準備し、神経前駆細胞をチャンバー上に転移させます。

最終ステップは、Galvan Axxisチャンバーに直流電界を印加し、タイムラプス撮影を行って神経前駆細胞の遊走を観察することです。最終的に、タイムラプス顕微鏡撮影により、分化および未分化状態における神経前駆細胞のガルバノタクシス特性を捉えます。この手法は神経前駆細胞のガルバノタクシスに関する知見を提供できるだけでなく、神経修復を促進するために病変部位へ神経前駆細胞を動員させるマウス脳卒中モデルなどの他のシステムにも適用可能です。

本手順の実演は、私の研究室の大学院生であるRob Pilley Postが行います。この手順を開始する際、遊離した一次ニューロスフィアを回収できる状態にするため、NPCを7日間培養しておく必要があります。必要に応じて、3枚の正方形ガラスを配置し、3つのGalvan Axxisチャンバーの準備を開始してください。

1つ目に、カバーガラスを6 Nの塩酸が入ったボトルに入れ、一晩浸漬させます。翌日の早いうちに、Matrigelを氷上でゆっくりと解凍させます。4時間後、チャンバーの構築に使用可能な状態になります。

まず、ダイヤモンドチップ付きガラスカッターを使用して、新しい正方形のカバーガラスから6枚の長方形のガラスストリップを切り出します。次に、酸洗浄した正方形および長方形のカバーガラスを、ラミナーフローフード内に移動させます。

ガラスストリップを70% ethanolで洗浄し、続いて組織培養グレードのオートクレーブ滅菌水で洗浄します。そのまま自然乾燥させるか、または糸くずの出ないペーパー上で乾燥させます。次に、正方形ガラススライドの片面の周囲に真空グリスを塗布し、60 millimeterのプラスチック製の底部に密封します。

シャーレ。長方形のガラスストリップの一面に真空グリースを塗り、正方形の反対側の端に密閉します。各皿の中央に中央溝を持つ正方形を作成するためのガラススライドを使用します。

これらの加工済みガラス正方形またはチャンバーを、フード内で少なくとも15分間UV滅菌します。次に、チャンバーの中央の溝に250〜300 µLのポリリシンをピペットで分注します。その後、チャンバーを室温で2時間インキュベートし、インキュベーション終了の約15分前に準備を整えます。

2時間後にMatrigel溶液を調製し、ポリリシンを吸引除去して、中央の溝を1 mLのオートクレーブ滅菌水で洗浄します。次に、250〜300 µLのMatrigel溶液を中央の溝にピペッティングし、チャンバーを37 °Cで1時間インキュベートします。インキュベーション後、Matrigel溶液を吸引除去します。

次に、中央の溝を1〜2 mLのSFMでそっと洗浄します。続いて、培養細胞の準備として、100 µLのE-F-H-S-F-MまたはF-B-S-S-F-Mを中央の溝にピペッティングします。次に、ニューロスフィアを含む培養液4〜5 mLを、新しい60 mmペトリ皿にピペッティングします。

次に、ペトリ皿を計数顕微鏡のステージ上に置き、5倍の対物レンズで観察します。P 10ピペットを使用して、5〜8個のニューロスフェア全体を各チャンバーの中央の溝に慎重に移します。最大4つまで。

ニューロスフェアは一度に移植しても構いませんが、中央の溝にあるニューロスフェアと混ざらないようにしてください。Matrigel基質を壊さないように注意しながら、周囲に慎重に分散させます。その後、中央の溝にさらに150 µLのE-F-H-S-F-MまたはF-B-S-S-F-Mを加えます。

次に、加湿されたインキュベーター内で細胞を培養します。培養開始から17〜20時間後、未分化のNPCが得られます。また、69〜72時間培養すると、分化したNPCが得られます。

計数顕微鏡下で、生細胞イメージングによる遊走解析に最適な細胞が含まれるチャンバーを選択します。細胞はほぼ完全にニューロスフィアから解離して丸くなっており、フード内で突起を形成していないか、あるいは形成し始めたばかりの状態である必要があります。チャンバーカバーを準備します。

正方形のガラスカバースリップを70% ethanolで洗浄し、次いでオートクレーブ滅菌水で洗浄した後、2つの平行な端に真空グリースの帯を塗布します。次に、チャンバーを覆います。まず、中央の溝から培地を吸引し、その後、屋根のようにカバースリップを長方形の壁の上に素早く密閉します。

次に、毛細管現象を利用して、新鮮な培地 100 µL を中央の溝に充填します。続いて、真空 그리스を用いて、培地を溜めるための境界を作成します。生細胞イメージングシステムの中央溝の両端に、あらかじめ準備しておいたアガロースゲルのチューブ、塩化銀電極、および 60 mm のペトリ皿 2 枚を用意してください。

培地のリザーバーとして機能させるため、チャンバーを37 °C、5% carbon dioxide環境下で20〜30分間静置します。この間に、2枚の空のペトリ皿の蓋とGalvan Axxisチャンバー用ペトリ皿の蓋に、ドレメルまたはツールピペットで穴を開けて準備します。中央のトラフの両側に1.5〜2 mLの培地を載せ、各空のペトリ皿に7〜8 mLのSFMを加えます。チャンバーの中央トラフの両側にペトリ皿を1枚ずつ配置し、各皿に電極を1本ずつ挿入します。

チャンバーとペトリ皿の間の隙間を埋めて、電気的連続性を確立します。Agaroseゲルのブリッジを用いて、電極を外部電源に接続します。この際、電流を測定するためにM計を直列に接続し、電源を入れます。また、V計を使用して、中央の溝に直接かかる電界強度を測定します。

必要に応じて電源装置の出力を調整します。次に、イメージングシステムのタイムラプスモジュールを開始します。Axio visionソフトウェアで「multidimensional acquisition」を選択し、「see」をクリックします。

チャンネルについてはチャンネル6を選択し、タイムラプス用のTをクリックします。タイムラプスの間隔設定を1分に、期間を8時間に設定し、「before」および「after」のタイムポイントフィールドにて、それぞれのタイムポイントを選択します。次に「start」をクリックし、必要な時間、実験を進行させます。アッセイ完了後、IHC解析に進みます。

運動学的解析の結果、250 mV/mmのDCEF存在下において、未分化NPCは、この電界強度で陰極に向かって非常に指向性の高い急速なガルバノタキシスを示すことが明らかになりました。未分化NPCの98%以上が、イメージングを行った6〜8時間の間、ずっと移動し続けました。A-D-C-E-Fがない場合は、細胞のランダムな移動が観察されました。

死細胞は遊走しないため、この結果は、これらの細胞がこの期間中生存していることを示唆しています。A-D-C-E-Fの有無にかかわらず、分化細胞のサブセットが存在する場合としない場合の両方において、分化した表現型はほとんど遊走しませんでした。突起が伸展し、DCEFの方向に対して垂直に並ぶ傾向が見られましたが、細胞体の顕著な転位は観察されませんでした。

免疫染色の結果、NPCは6時間のDC EF曝露後も神経前駆細胞マーカーであるnestinの陽性発現を維持していることが確認されました。成熟した表現型への分化を誘導したNPCを用いたアッセイでは、6時間のDCEF曝露後、大半の細胞が成熟アストロサイトマーカーである glial fibrillary acidic protein（GFAP）を発現しました。この手順を用いることで、遺伝的ノックアウトモデルを利用し、直流電場を細胞運動へと変換する細胞メカニズムについての知見を得ることができます。

または、例えば次のような例があります。