マウス副腎クロマフィン細胞における細胞 - 添付容量測定のための方法

この手順の全体的な目標は、単一の小胞、細胞症、およびエンドサイトーシスを検出することです。これは、まずマウスの副腎組織のクリーンで完全な消化を得ることによって達成されます。2番目のステップは、副腎から細胞を解離してプレート

次に、クロミン細胞を同定し、パッチクランプして細胞付着容量記録を取得します。最終的には、単一の小胞、細胞症、およびエンドサイトーシスを観察できます。この手法は、単一イオンチャネルの細胞付着記録などの既存の方法と比較した場合の主な利点として、単一小胞のエキソサイトーシスとエンドサイトーシスを検出できることです。

この方法の視覚的なデモンストレーションは、ギガシールの取得が難しいために役立ちます。また、プレート内に見られる混合細胞タイプの中から細胞を特定するのが難しい場合があります。手術の準備をするには、大小の解剖、はさみ、2組の鉗子をオートクレーブすることから始めます。

次に、解剖トレイをアイスバケツの上に置きます。また、5%の二酸化炭素と95%の酸素で酵素溶液を泡立て始めます。溶液は、バブリングする前に明るいピンク色です。次に。

新生児を3日齢のマウスに安楽死させて斬首した後、小さなハサミのセットを使用して、頸部から脊髄部までの背骨に続く子犬の背中を切り取ります。体腔に穴を開けないように、皮膚の下を表面的に切ってください。次に、脊椎から皮膚を剥がして、筋肉組織が露出し、脊柱がはっきりと見えるようにします。

次に、頸髄に横断的な切り込みを入れ、次に脊椎の側面に沿って2つの平行な切り込みを入れ、1対の鉗子で動物の本体を保持します。もう一方の鉗子を使用して脊柱をつかみ、腎臓が露出するまで脊椎を剥がします。腎臓の上にある副腎の位置を特定したら、鉗子を使用して副腎を取り除きます。

次に、副腎をロック溶液で満たされた円錐形のチューブに慎重に配置します。2組目の鉗子を使用して副腎を取り除きます。それらが最初の鉗子のペアにくっついている場合は、円錐形のチューブを氷の上に置きます。

グランドは、最大2時間ロック溶液に保持できます。この時点で、酵素溶液をチェックして、平衡化した溶液が明るいピンク色からピンクがかったオレンジ色に変わったことを確認します。次に、新たに泡立たせた酵素溶液にパペを最終濃度20〜25単位/ミリリットルで加えます。

次に、プロパン酵素溶液を新しい円錐形のチューブに加え、鉗子を使用して副腎をプロパン酵素チューブに移します。37°Cで40〜60分間腺をインキュベートします。次に、各チューブに75%の不活化溶液を加え、摂氏37度でさらに10分間インキュベートします。

10分後、腺を新しく標識したチューブにそっと移し、培地で腺を3回洗浄します。洗浄後、腺を200マイクロリットルの培地に入れ、次に200マイクロリットルのピペットチップを介して腺を上下に穏やかに滴定します。滴定するときは、200マイクロリットルのピペットチップからの下向きの力でチューブの底に腺を維持し、組織を穏やかかつゆっくりと噛み合わせますゆっくりとした連続ストロークを使用するようにしてください、滴定後すぐにまたは突然ピペッティングすることはなく、培養培地の総容量を最大450マイクロリットルにするために、さらに250マイクロリットルの培養培地を追加します。

次に、7つの12 mm PDLプレコートカバーが60 x 50 mmの培養皿プレートに入れられます。次に、溶液を含むセルの60マイクロリットルを7つのカバースリップのそれぞれにプレートします。メッキしたら、皿を摂氏37度のインキュベーターに30分間置きます。

インキュベーション後、5ミリリットルの温熱培地を培養皿に静かに加え、24時間インキュベートしてから細胞付着記録を行います。インキュベーション場所の後、副腎細胞を含む12ミリメートルのカバースリップを細胞外溶液に入れます。副腎全体が使用されたため、次のステップはクロミン細胞と皮質細胞を区別することです。

培養では、クロミン細胞は通常非常に明るく、茶色がかったベージュ色とほぼ完全な円形の形をしています。対照的に、皮質細胞はCHRO細胞よりも小さく、淡色です。テキストプロトコルに記載されているようにパッチピペットを引っ張った後、ピペットの先端を溶かしたワックスに浸して、ガラスの静電容量を減らします。

次に、チップをファイヤーポリッシュして、ピペットチップの内側からこのワックスを吹き飛ばします。次に、パッチピペット溶液を使用してピペットを組み立て、その抵抗が約2メガオームになるようにします。パッチピペットをマニピュレーターに取り付け、細胞から数ミクロン以内に持っていきます。

ピペットを前進させ続け、わずかな細胞の変形がないか探します。変形が見つかったら、ギガオムシールが達成されるまで穏やかに吸引します。セル接続構成を生成します。

ギガオムシールが明らかになったら、EPC 7プラスパッチクランプアンプとテキストプロトコルで説明されている2フェーズアナログロックインアンプを使用してセルアタッチ録音を行い、ロックインアンプの位相を設定します。これは、穏やかな吸引によって生成される過渡容量の変化です。パルスはパッチ容量にのみ現れるか、パッチに投影されないImトレース、コンダクタンス、またはパッチングプロセスの再トレースが機械的刺激として機能します。通常、作用電流はほとんどのセルから記録できるため、マークされた下向きのステップで典型的な静電容量の変化を特定します。

最後のステップは、将来の分析のためにデータを保存することです。ここに示されているのは、複数の下向きステップを持つ典型的なセル接続容量記録です。各下降ステップは、単一のiCalエンドサイトーシスに関連付けられています。

マスタリングすれば、細胞培養は2〜3時間で完了し、発生後4日以内に記録を行うことができます。この技術は、シナプス伝達の分野の研究者が神経内分泌クロミン細胞におけるシナプス小胞のリサイクルを探求する道を開きました。