転写開始点を決定するための蛍光に基づくプライマー伸長技術とのRNaseの切断サイトインビボ

この手順の全体的な目標は、蛍光プライマー伸長反応を使用して、転写の開始点とRNAがin vivoで細菌から切断部位を特定することです。これは、最初に大腸菌やSアリアなどの細菌を増殖させ、RNA分子を単離することによって達成されます。次に、特定の蛍光プライマーと逆転写酵素を使用してRNAを逆転写し、CD NAフラグメントを作製します。

次に、DNAまたはプラスミドを細菌細胞から単離し、シーケンシングキットを使用してDNAテンプレートから蛍光サンガーシーケンシングラダーを作成します。最後に、CDNAフラグメントとシーケンシングラダーを分離し、自動ゲルシーケンサーを使用してポリアクリルアミドゲル上で同時に検出し、互いに比較します。最終的に、蛍光プライマー伸長法は、RNA分子の5つのプライム末端を1塩基の分解能までマッピングするために使用されます。

この手法が、人種や放射能に基づく一次伸長などの他の方法よりも優れている点は、電気泳動中に同時に検出が行われるため、RNA分子の末端から5つを迅速に同定できることです。感度は赤活性ベースの一次伸長と似ていますが、実験室の担当者は、レート放射能放射線安全トレーニングを必要とせずにこの方法を使用できます。私たちは、この蛍光一次伸長技術を使用して、毒素抗毒素系のRNA成分を調べることに成功しました。

この手順を実演するブドウ球菌は、私の研究室の大学院生であるChristopher Schusterです。高収率のRNAを調製し、テキストプロトコルに従ってプライマーを設計した後、最初にサーモサイクラーを摂氏95度に予熱してプライマー伸長反応を行います。各RNAサンプルについて、以下の化合物をPCRチューブ内で混合し、サンプルを摂氏95度で1分間変性させます。

次に、チューブを氷上に5分間置き、プライマーとRNAをハイブリダイズします。次に、PCRマシンを摂氏47度に設定します。次に、ここで説明するように逆転写マスターミックスを準備します。

4マイクロリットルの逆転写マスターミックスを各ハイブリダイズRNAサンプルに加え、チューブを摂氏47度で1時間インキュベートします。反応を停止するには、サンプルを摂氏95度に2分間加熱します。次に、6マイクロリットルのフォームアミドローディング染料を加え、マイナス20°Cの暗所で一晩または最大2週間保管します。

ゲノムDNAまたはプラスミドを調製した後、テキストプロトコルに従って、約10〜15マイクログラムのゲノムDNAまたは100〜500ナノグラムのプラスミドDNAの12マイクロリットルを蛍光標識プライマーおよびDMSOピペット1マイクロリットルと混合することにより、サンガーシーケンシング反応を組み立てる。各シーケンシングの1マイクロリットルを別々の標識済みPCRチューブに混合します。次に、各チューブに3マイクロリットルのD-N-A-D-M-S-Oプライマーミックスを追加します。

PCR装置を以下のプログラムに設定し、サンプルを装置に入れてから実行してください。分析後、6マイクロリットルのローディング色素をサンプルに加え、次に氷上に置きます。ほこりのない清潔な25センチプレートを使用して、すぐに使用する場合、または摂氏マイナス20度で長期間使用する場合は、背面ガラスプレートに0.25ミリメートルスペーサーを配置し、ガラスプレートのノッチ付き端とレールエントリーパイロットの両方を上に向けて上部のノッチ付きガラスプレートを下げます。

ガラスプレートの両側にゲルレールを取り付け、つまみを軽く締めてゲルをキャストします。ここにリストされている化合物をビーカーと攪拌子で組み合わせ、磁気攪拌板に置きます。PSを添加してチーム化した直後に、50ミリリットルのシリンジを使用してアクリルアミド溶液を取り込み、先端に0.45ナノメートルのフィルターを配置します。

挟まれたプレートを10〜20度の角度で置き、シリンジの先端を一方の側から他方の側に連続的に動かしながら、ガラスプレートの間にゲル溶液をゆっくりと分注します。ゲル溶液がガラスプレートの下端に接触したら、ゲル溶液の分注を停止します。バブルフックを使用して、形成された可能性のある気泡をすべて取り除きます。

次に、切欠きのある端でガラスプレートの間にゲルポケットスペーサーをスライドさせ、ゲル溶液に浸し、キャスティングプレートを取り付けて固定し、上部レールネジを軽く固定し、ゲルを1〜2時間硬化させます。キャスティングプレートとポケットスペーサーを取り外す前に、蒸留脱イオン水を使用して、塩とゲルの残留物のポケットを洗浄し、ゲルを流します。バッファータンクホルダーをフロントガラスプレートのゲルレールにスライドさせ、ノブを締めます。

ゲルを自動ゲルイメージャーの下部ゲルタンクに加熱プレートに当てて置き、レールエントリーパイロットを装置ブラケットにスライドさせて固定します。1つのXTBEバッファーを使用して、上部と下部のゲルバッファーチャンバーを充填します。次に、下部バッファチャンバーを閉じ、電源コードを使用して上部バッファチャンバーを電源に接続します。

ゲルポケットに塩分が含まれている場合は、バッファーを使用してポケットに繰り返しピペットで入れて清掃します。次に、上部バッファー蓋を使用して、上部バッファータンクチャンバーを閉じます。イメージャーとコンピューターの電源を入れ、テキストプロトコルに従ってベース画像IRデータ収集ソフトウェアを起動した後、ここに記載されている設定を使用してスキャナーコントロールを設定します。

次に、電圧オンを選択し、Enterキーを押して、空のゲルを20分間事前実行します。その間、PCRマシンを使用して、シーケンシングラダーとプライマー伸長製品を摂氏90度に2分間加熱します氷上で冷却する前に、電気泳動を停止し、自動ゲルシーケンサーを開き、上部バッファータンクの蓋を取り外します。次に、サメの歯の櫛をガラス板の間とサメの歯と一緒に挿入します。

ゲルピペットにプライマー伸長製品の1〜2マイクロリットルをわずかに突き刺すか、ラダー反応を各ゲルポケットにシーケンシングします。空のポケットに。ローディング染料を使用してそれらを充填し、一貫性のないランニング動作を防ぎ、バッファータンクとゲルシーケンサーのドアを閉じます。

次に、レーザーの電圧オンを選択し、スキャンステータスをオンにして電気泳動を開始し、Enterキーを押します。対象領域がレーザーを通過したら、ここに示すように電気泳動を停止します。プライマー伸長反応は、目的の転写産物の転写開始点またはTSPを決定するために使用でき、プロモーター領域の推定に役立ちます。

この例では、MPE mRNAのTSPは、以前に発表されたデータと一致するGとして同定されました。マイナス35およびマイナス10のプロモーターエレメントは、T-T-G-T-A-AおよびT-A-G-A-C-Tであると推定され、これらのモチーフは、プライマー伸長を使用してmRNA切断産物を同定することにより、各コンセンサス配列の塩基とのみ異なります。ここには、RNAが存在しないか不活性な場合に、RNAが存在しないか不活性な場合に、STARTcoonに近い切断のRNAマッピングが示されており、RNA活性の結果としてSTARTcoonの近くにプライマー伸長産物が形成されません。

しかし、この図ではスタートコートのすぐ下流に2つの強いバンドが現れており、逆転写反応の過剰なRNAが個々のバンドの同定を妨げているため、プライマー伸長実験が失敗したことを示しています。これは、テンプレートRNAの総量を目的のRNAの存在量に合わせて調整する必要があることを示しています。このビデオを見た後、蛍光プライマーと自動ゲルシーケンサーを使用してin vivoで転写開始点とRNA切断部位を解明する方法について、ある程度の練習を積んでよく理解できるはずです。

この方法は、すばやく簡単に実行できます。あなたの実験に頑張ってください。