モデルとしての嗅覚系は、軸索の成長パターンと形態を研究するインビボ

この手順の全体的な目標は、in vivo で嗅覚ニューロンを標識して、軸索の形態と発達を視覚化することです。これは、最初にフルオロ4結合デキストランを単一の嗅覚ニューロンに穴を開けることによって達成されます。2番目のステップは、色素が感覚ニューロンの軸索突起に広がるのを24時間待つことです。

次に、オタマジャクシに麻酔をかけ、多光子顕微鏡を用いて嗅球の3次元画像スタックを取得します。最後のステップは、指定された時間間隔の後に同じ動物で標識されたニューロンを繰り返し調べることです。最終的に、細胞形態の再構築により、軸索形態の変化を視覚化することができます。

この方法は、軸索が前脳の標的領域に向かってどのように成長するか、シナプスがどのように形成されるかなど、神経科学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。実験前。エレクトロポレーションのセットアップが、作動距離の長い実体顕微鏡で構成され、蛍光照明と染料用のフィルターセットが装備されていることを確認してください。

エレクトロポレーションには、専用のシングルセルエレクトロポレーションを使用するか、オシロスコープに取り付けられた汎用の矩形パルス発生器を使用します。エレクトロポレーション出力をピペットホルダーとバス電極に接続します。ピペットホルダーとバス電極の両方に、塩化銀の薄層でコーティングされた銀線が含まれていることを確認してください。

次に、ピペットホルダーをマイクロマニピュレーターに取り付けて、正確な位置決めを可能にします。その後、内部フィラメントを有するホウケイ酸ガラスキャピラリーを用いてエレクトロポレーション用のマイクロピペットを作製します。マイクロピペットの極性のパラメータを設定することで、シングルセルエレクトロポレーション用の高いシャンクと小さなチップ開口部のマイクロピペットを作製することができます。

次に、専用のシングルセルをエレクトロポレーションしてピペット抵抗を直接測定します。この手順では、フルオロ4結合デキストランをカエルリンガーに3ミリモルの濃度で溶解します。このストック溶液を小さなアリコートに分割し、将来の使用のために1つを冷凍庫に保管します。

次に、マイクロピペットに1〜5マイクロリットルのデキストラン溶液を埋め戻します。マイクロピペットを慎重にフリックして、ピペットの先端に残っている気泡を取り除きます。次に、マイクロピペットをピペットホルダーに取り付けます。

ピペット内部の銀線が染料溶液に接触していることを確認してください。次に、ティッシュの小片をペトリ皿に入れ、0.02%トリカを含む少量の水で覆います。次に、0.02%トリカを含む水中で変成前のオタマジャクシを麻酔します。

それに触れて、それが反応しないことを確認して、適切な麻酔を確認します。次に、オタマジャクシをティッシュで覆われたペトリ皿に慎重に移します。電極が湿った組織に接触していることを確認し、マイクロマニピュレーターを使用してマイクロピペットの先端をオタマジャクシの嗅器官の近くに配置します。

その後、嗅覚器官を覆う皮膚に浸透します。ピペットチップを使用して、先端を主要な嗅上皮またはMRO鼻上皮の中央に位置する感覚ニューロン層に慎重に進めます。次に、正の方形電圧パルスをトリガーして、単一の電圧極または複数のパルスの列を印加することにより、色素を感覚ニューロンに移します。

次に、蛍光実体顕微鏡を使用して、成功した色素押出しとエレクトロポレーションを視覚化します。この色素は、エレクトロポレーションが成功した後、細胞体と樹状突起に急速に広がります。オタマジャクシの第2の嗅覚器官の手順を繰り返した後、オタマジャクシを真水で満たされたビーカーに移して回復させ、エレクトロポレーションされた色素を感覚ニューロンと嗅球に広げます。

エレクトロポレーションの少なくとも24時間後に、0.02%トリカを含む水中でオタマジャクシを麻酔します。.次に、オタマジャクシを慎重にイメージングチャンバーに移します。パラメータのストリップから小さな長方形を切り取ります。

次に、オタマジャクシをパラメータで覆い、切り欠き窓から前尾のセファロンを残します。オタマジャクシを傷つけずに皿に針でパラムを固定し、オタマジャクシが0.02%トリカを含む十分な水に沈められていることを確認します。その後、イメージングチャンバーを直立多光子顕微鏡または共焦点顕微鏡のステージに取り付けます。

嗅球の画像の3次元スタックを取得し、イメージング手順が10〜15分を超えないようにします。その後、オタマジャクシを別のタンクで通常の水に戻し、光が当たらないようにします。この画像では、異なるフルオロ4つに結合した4つのデッキストランドが、嗅器官の4つの離れた場所でエレクトロポレーションされ、外側は緑色で示され、中間体は黄色で示され、内側は赤で示され、鋤骨鼻器官はオレンジで示されました。

これにより、副嗅球と主嗅球の3つの主要な投影野を視覚化することができます。この画像は、嗅球の構造に重ね合わせた単一の嗅覚ニューロンの異なる軸索成長パターンの3次元再構成を示しており、これは単一の嗅覚ニューロン軸索が嗅球に突出し、球状糸球体に房状の樹状化を形成する例を示しています。ここOpus Levuで見られるように、これらの軸索は、1つ、2つ、または複数のgmerに接続する前に定期的に分岐します。

これは、軸索形態の連続的な変化を示すin vivoタイムラプスイメージングによって繰り返し調べられた個々の嗅覚ニューロンの代表的な例です。このビデオを見れば、エレクトロポレーションによる嗅覚ニューロンの標識方法と、in vivo TimeLapseイメージングを使用して嗅覚ニューロンの発達をモニタリングする方法について十分に理解できるはずです。