メカニカルストレッチ中のライブセルイメージング
2015年8月19日
新しいイメージングプロトコルは、カスタムモーター駆動の機械式アクチュエータを使用して開発され、生細胞の機械的ひずみに対するリアルタイムの応答の測定を可能にしました。メカノバイオロジーに関連して、このシステムは最大20%のひずみを適用でき、共焦点顕微鏡または原子間力顕微鏡によるほぼリアルタイムのイメージングを可能にします。
次の実験の全体的な目標は、細胞メカノバイオロジーに対する機械的ひずみの役割をほぼリアルタイムで観察することです。これは、まず、細胞を増殖させ伸ばすための柔軟な膜を持つシステムを構築することによって達成されます。2番目のステップとして、メンブレンを伸ばして、メンブレンひずみでモーターカウントを校正します。
次に、マウスの肺上皮細胞を伸ばし、核をイメージングします。膜ひずみが細胞に伝達されることを示すために、ストレッチャーをナノインデンテーション用のA FMに組み込み、ストレッチ前後の個々の細胞の剛性を測定します。結果は、適用されたストレッチによる細胞への直接的な損傷を示しています。
また、蛍光イメージングに基づくと、活性酸素種の産生は伸張とともに増加することが示されています。この方法は、上皮細胞が人工呼吸器で損傷を受ける可能性があるかどうかなど、肺の機械生物学分野の重要な質問に答えることができます。この方法は、肺細胞、機械生物学に関する洞察を提供するだけでなく、肝臓や成長板スライスなどの他の軟組織にも適用できます。
一般に、この方法に不慣れな個人は、原子間力顕微鏡などのこれらの実験で使用されるツールの型破りな組み合わせのために苦労するでしょう。まず、付属のテキストプロトコールに記載されているように、細胞培養で使用するために修飾したコラーゲンコーティングPDMSメンブレンを調製します。次に、マウス肺上皮細胞をウェルあたり250万個の細胞で、無菌の柔軟なコラーゲンコーティング膜に播種します。
細胞がコンフルエントに達するまで、細胞を摂氏37度および5%CO2で2日間インキュベートします。次に、1.5ミリメートルの生検パンチを使用して、プリテンションが不要な場合は、コンストラクトの中心から20.5ミリメートルの6つのクランプタブのそれぞれに2つの穴を開けます。そして、細胞培養培地を取り出します。
機械式アクチュエータがゼロひずみ位置にあることを確認し、パンチ穴がピンとクランプと揃うようにメンブレンをストレッチャーに配置します。トップクランプを所定の位置に置き、ネジを一度に1つずつ、異なる側面を交互に締めます。デバイスを顕微鏡ステージに置く前に、1ミリリットルの細胞培養培地を添加します。
デバイスを光路の中央に配置します。次に、デバイスをステージに固定します。目的地入力ブロックの顕微鏡のステージコントローラーを使用して、機械装置の平面内位置と垂直位置を調整して、膜に焦点を合わせます。
適用する目的のひずみレベルに対応するモーターカウント値を入力します。次に、Velocity Input ブロックの値を 10 RPM 以下に設定して、顕微鏡の対物レンズに対して磁場がシフトする可能性があるため、伸張の前後で同じ視野を観察するため、伸張中に顕微鏡のステージを調整する必要がある場合があります。すべての設定が完了したら、[実行]をクリックします。
原子間力顕微鏡の調整から始めます。a FMヘッドの高さをZ方向の最大位置まで上げます。次に、脚にエクステンダーを取り付けて、FMカンチレバーがサンプルに接触する平面を持ち上げます。
次に、A FMスキャナープレートと目的の対物レンズを顕微鏡から取り外します。対物レンズにスペーサーを追加し、顕微鏡に取り付け直します。次に、スキャナープレートをAFMMに戻します。スペーサーの高さは、対物レンズや特定のFM設定によって異なりますが、光学イメージングが必要な場合は、観測計画がZ方向にシフトするため、スペーサーを使用する必要があります。
次に、A FMソフトウェア、光学顕微鏡ソフトウェア、および蛍光測定用の光源を含むすべての必要な光源を起動します。A FMで生細胞の弾性率を測定するために、ナノメートルあたり200ピコニュートン以下の剛性を持つカンチレバービームを備えたチップをマウントします。次に、レーザーの位置を合わせ、次にガラスカバースリップをデバイスに取り付け、それを使用してメーカーの提案に従ってカンチレバーの剛性を校正します。メンブレンを延伸装置に取り付ける直前に、壁を高さ約1ミリメートルに切ります。
これにより、メンブレン壁とロードセルとの間に生じる干渉が減少します。次に、細胞培養培地を取り出し、メンブレンを機械装置に取り付けます。ソフトウェアを使用して、アダプター付きの機械装置をスキャナーに配置します。
ナノインデンテーションの前に、メンブレンを所望の引張ひずみレベルまで引き伸ばします。細胞に0.5ミリリットル以下の培地を添加して水分を補給しますが、FMスキャナーや顕微鏡を損傷する可能性のあるこぼれないように注意してください。次に、カンチレバービームをメンブレンにかみ合わせます。
特定のAFMデバイスのプロトコルに従って、関心のある領域をスキャンします。膜上に播種した細胞に20%のひずみを適用したとき、細胞はここに示されているように20%変位し、活性酸素種の産生に対する細胞の影響を、添付のテキストプロトコルに記載されているように、累積ミトコンドリアスーパーオキシドセンサーを使用して気管支上皮細胞で測定した。機械的なストレッチがない場合、17%のストレッチを1回適用して維持した場合、ROSの生成は60分間で大幅に増加しませんでした。
ミトコンドリアのROSが増加し、これは機械式ストレッチャーを原子間力顕微鏡に組み込むことでさらに60分間持続しました。弾性率、10%引張ひずみ前後のマウス肺上皮細胞のマップを、ここで概説した領域から取得しました。40 x 40 マイクロメートルの領域にわたって 300 の個別の強制変形曲線が記録され、ひずみの適用による高弾性領域の局在化の変化が示されました。
一度習得すれば、細胞のストレッチは15分で完了します。FMナノインデンテーションは、この手順を試行する際に適切に実行するために2時間かかる場合がありますが、データが報告される前に、結果が攪拌や長時間の室内空気曝露によって悪影響を受ける可能性があるため、細胞を慎重かつ迅速に取り扱うことを覚えておくことが重要です。FMでの作業は非常に難しい場合があることを忘れないでください。
この手順を実行するときは、すべての液体をスキャナーから遠ざけるなどの予防措置を講じる必要があります。
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概要
本研究では、生細胞における機械的ひずみ応答のリアルタイム観察を可能にする新しいイメージングプロトコルを提示します。カスタム設計のモーター駆動式機械アクチュエーターを用いることで、最大20%のひずみを負荷しながら、共焦点顕微鏡または原子間力顕微鏡によるほぼリアルタイムのイメージングを実現するシステムを構築しました。
研究の主要構成要素
科学分野
- メカノバイオロジー
- 細胞イメージング
- 生細胞メカニクス
背景
- 細胞に対する機械的歪みの影響を理解することは、メカノバイオロジーにおいて極めて重要です。
- リアルタイムイメージング技術により、細胞応答の研究が促進されます。
- 機械的歪みは、細胞の挙動や完全性に影響を及ぼす可能性があります。
- 従来の手法では、リアルタイムの応答を効果的に測定する能力が不足していました。
研究の目的
- 細胞のメカノバイオロジーにおける機械的ひずみの役割を、ほぼリアルタイムで観察すること。
- 細胞に印加されるひずみの校正が可能なシステムを開発すること。
- 機械的伸展前後の細胞の剛性を測定すること。
使用方法
- 細胞の培養および伸展のためのフレキシブルメンブレンを備えたシステムの構築。
- モーターカウントとメンブレン歪みのキャリブレーション。
- マウス肺上皮細胞の伸展および核のイメージング。
- ナノインデンテーションのための原子間力顕微鏡へのストレッチャーの組み込み。
主要な結果
- 機械的なストレッチの印加により、細胞への直接的な損傷が観察された。
- リアルタイムイメージングにより、歪みに対する細胞応答についての知見が得られた。
- 開発したシステムは、膜の歪みを細胞へ効果的に伝達した。
- 剛性測定により、ストレッチ後の細胞特性の変化が示された。
結論
- この新しいイメージングプロトコルにより、メカノバイオロジカルな応答の詳細な研究が可能になります。
- リアルタイム観察により、歪み条件下における細胞力学の理解が深まります。
- このアプローチを応用することで、さまざまな状況下における細胞応答をさらに詳しく調査できます。
よくある質問
産業界における重要性
機械的伸展中のリアルタイム生細胞イメージングにより、メカノバイオロジー的な応答を直接観察することが可能となり、初期探索およびターゲットバリデーションにおける予測的な信頼性が向上します。このアプローチは、呼吸器系および軟組織疾患モデルに関連する細胞損傷メカニズムについて実用的な知見を提供し、リスク調整後のポートフォリオ決定に寄与します。共焦点顕微鏡および原子間力顕微鏡（AFM）を機械的駆動装置と統合することで、前臨床研究におけるメカニズム的なリスク低減の精度と再現性が向上します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲット検証
- 機械的歪みに対する細胞応答の解析を可能にし、メカニズム上の経路を明らかにします。
- 細胞の剛性変化および活性酸素種（ROS）の産生量を定量化することで、機能的な標的バリデーションをサポートします。
- さらなる開発に向けた疾患関連標的の選択における予測精度の向上を促進します。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- メカノバイオロジー調節化合物のダウンストリームスクリーニングに向けて、検証済みの生細胞システムを調製します。
- 再現性のあるアッセイ開発のために、弾性率やROSレベルなどの定量的出力を標準化します。
- 生理学的に適切な機械的条件下で、化合物の効果を信頼性高く評価することを可能にします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- in vitroの機械的損傷モデルを疾患に関連するエンドポイントと整合させ、トランスレーショナルなバイオマーカー探索を可能にします。
- 損傷表現型の直接測定を可能にすることで、探索から前臨床検証までの連続性を提供します。
- 細胞損傷とストレス応答を定量化することで、リスク調整に基づいた推進決定をサポートします。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、機械的刺激に対する細胞応答のリアルタイムかつ定量的な評価を可能にすることで、初期探索、リード化合物の同定、および前臨床的なメカニズム研究を橋渡しするものです。
- 探索生物学： 生細胞におけるメカノトランスダクションおよび傷害経路の仮説検証をサポートします。
- スクリーニング： アッセイの標準化および化合物のトリアージに向けた、再現性のある定量的なリードアウトを提供します。
- 分析： 比較分析のため、細胞の剛性とROS産生のハイコンテンツ測定を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ： in vitroでの知見を、肺やその他の軟組織における疾患に関連した傷害メカニズムへと結びつけます。
- 企業での再利用： 複数の組織タイプやメカノバイオロジーの研究課題に適応可能な、再利用可能なプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を高め、メカニズム上の曖昧さを低減します。
- 運用上の価値：メカノバイオロジーアッセイの標準化、再現性、およびスケーラビリティを向上させます。
- 戦略的価値：早期にメカニズム的な洞察を提供することで、GO/NO-GO判定の精度を高め、資本効率を改善します。
- ポートフォリオへの影響：メカニズム的に検証されたターゲットの、リスク調整済み優先順位付けおよび開発の推進を可能にします。
実施上の考慮事項
- 生細胞イメージング、AFM操作、および機械的作動システムの専門知識が必要です。
- 共焦点顕微鏡および適合するアクチュエータを備えたAFMなどの特殊な装置が必要です。
- 再現性のある歪み校正およびデータ取得のためには、チーム間での厳格な標準化が不可欠です。
- 基板およびアクチュエータの適合性に応じてプロトコルを修正することで、さまざまな細胞および組織モデルに適用可能です。
- 細胞の撹拌や環境への曝露によるアーティファクトを最小限に抑えるため、慎重な取り扱いと迅速な実行が極めて重要です。
