集積光と原子間力顕微鏡による研究機械的刺激に対する細胞応答を生きる

機械的刺激に対する細胞のリアルタイム応答の研究は、まずGFP融合タンパク質を発現させた細胞をガラスボトムディッシュで24時間培養することから始まります。次のステップでは、AFMチップをビオチン化フィブロネクチンでコーティングします。その後、機能化されたAFMチップを細胞表面に接触させ、AFMチップの周囲に強固な焦点接着を形成させます。これにより、フィブロネクチンでコーティングされたチップと細胞との間のマトリックス・インテグリン・アクチン連結を介して、アクチン細胞骨格を直接操作することが可能になります。

最終ステップは、AFMチップを制御しながら上方に移動させ、生細胞を機械的に刺激することです。これにより、強力な焦点接着を破壊することなく、細胞の接触点に垂直方向の力が加わります。最終的に、リアルタイム蛍光光学イメージングで記録された結果から、細胞は基質への接着を強化し、アクチン細胞骨格の再編成を誘導することで、機械的刺激に反応することが示されました。こんにちは、テキサスA&Mヘルスサイエンスセンターのシステム生物学・トランスレーショナル医学部の助教授、Andrea Trakeです。

こんにちは、Sum Limです。私はテキサスA&Mヘルスサイエンスセンターのシステム生物学・トランスレーショナル医学部門で博士研究員を務めています。本日は、機械的刺激に対する細胞の適応的リモデリングを研究するための手順をご紹介します。

当研究室では、生きた血管平滑筋細胞における細胞骨格のリアルタイムな再構成を調べるためにこの手順を用いています。それでは、始めていきましょう。これらの研究では、全内部反射蛍光（TIRF）アタッチメントとCSU 22 Yokogawaスキャニングヘッドを組み合わせたOlympus IX 81倒立顕微鏡を使用します。

倒立光学顕微鏡の上にBio Scope SZ原子間力顕微鏡が搭載されています。システム全体は研究グレードの光学定盤上に設置されており、その詳細は既報の通りです。この統合顕微鏡では、2台のQuant EM電子増倍電荷結合素子（EMCCD）カメラを使用しています。

一方はターフイメージング用であり、もう一方は共焦点イメージング用です。回転円盤スキャナー、外部フィルターホイール、およびE-M-C-C-Dカメラで構成される共焦点アッセンブリは、振動減衰に必要なシリコンパッドの上に配置されたアルミニウムベースプレートに取り付けられています。共焦点アッセンブリ全体は、ネジ付きカラーを備えたフランジを介して顕微鏡に接続されます。

これにより、スピンディスクスキャナーからの振動を避けるため、原子間力顕微鏡（AFM）またはFM測定時にアセンブリを顕微鏡から切り離すことができます。アルゴンクリプトンレーザーが、turfおよび共焦点イメージングモードの両方の励起光源として使用されます。レーザーは2本の光ファイバーのいずれかに結合させることができ、これによりレーザーがturfアタッチメントまたは共焦点スキャンヘッドに供給されます。

2台のコンピュータでシステムを制御します。1台はスライドブックソフトウェアを用いて光学イメージングを制御し、もう1台はナノスコープソフトウェアを用いてAFMを制御します。機械的刺激実験の24時間前に、特定のタンパク質を標的としたGFPコンストラクトを発現させた生細胞を、ガラスボトム細胞培養ディッシュに播種します。実験当日、細胞培養培地をフェノールレッドフリー培地に変更します。

a FM実験はノイズに非常に敏感であるため、ノイズを最小限に抑えるために、実験中は会話を避け、光学定盤や顕微鏡に触れないようにしてください。a FM測定では、回転ディスク共焦点顕微鏡を顕微鏡本体から切り離します。まず、磁気カラーを用いて細胞培養ディッシュを磁気顕微鏡ステージに固定し、a FMステージに装着することから実験を開始します。

AFMプローブのV字型カンチレバーには、2 µmのビオチン化ガラスビーズが装着されています。カンチレバーは顕微鏡で容易に確認できます。ビーズはカンチレバーの最先端に接着されており、ここにコーティング溶液を滴下します。

実験用のFMプローブを準備するには、まずチップをガラスホルダーに取り付け、次にチップをコーティングするためにガラスホルダーをテーブルマウントに設置します。チップの先端に10 µLのdocosリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）を慎重に滴下してチップを洗浄し、キムワイプでチップを拭き取ります。1 mg/mLのDPBSで洗浄した後、この手順を5回繰り返します。

Avidを溶液中に準備します。チップの先端に滴下します。Avadonコーティング後、チップを5分間インキュベートします。

チップをDPBSでさらに5回洗浄します。次に、1 mg/mLのビオチン化フィブロネクチン溶液をチップに滴下し、5分間インキュベートして、アバドン上に架橋させます。

最後に、チップをDPBSでさらに5回洗浄し、チップの先端に最後の一滴を残します。チップの準備が完了したら、チップをa FMスキャナーに取り付けます。a FMチップを取り付けた後、ホルダーの周囲に保護用シリコンスカートを配置します。

次に、ビデオ観察用に顕微鏡をセットアップします。続いて、FMチップを視野の中心に合わせます。レーザービームをカンチレバーの最先端に配置し、光学レバーを設定します。

次に、単一細胞イメージングに適した高倍率の対物レンズに切り替えます。続いて、機械的刺激を与える細胞を視野に入れ、AFMチップを細胞表面のどの位置に着地させるかを選択します。最後に、AFMチップを、その特定の細胞に接触するまで降ろします。

チップを細胞に接触させた後、約20分間待ちます。これにより、細胞表面のFM接触点に強力な焦点接着が形成されます。待機期間の後、機械的刺激実験の準備として、機械的刺激の手順を開始することができます。

ビデオカメラからEMCCDカメラに切り替え、イメージング用に蛍光細胞を視認できるようにします。次に、静止状態にある細胞の初期画像を撮影します。スピニングディスク共焦点顕微鏡を用いて、細胞体全体のアクチン細胞骨格を可視化します。

逆に、細胞を刺激するために、ターフを用いて焦点接着を可視化します。カンチレバーを使用して、3〜5分ごとに不連続なステップで制御された上方への移動を適用します。AFMデータを取得している間、オペレーターはZピエゾ位置の電圧を常に監視し、垂直方向の操作の適切なタイミングを判断することが重要です。

FMデータの取得と同時に、Slidebookソフトウェアを用いて、垂直方向の牽引を行うたびに細胞の共焦点またはTURF画像を取得します。刺激実験の完了後、最後にaFMチップを細胞から取り出します。actin MRFPおよびvculをトランスフェクトした血管平滑筋細胞。

FMを用いて、細胞頂端面のGFPを撮像しました。同じ細胞の細胞基底面をturfを用いて撮像しました。ここでは、これら2つの画像を重ね合わせています。

同じ細胞の画像は、回転円盤共焦点顕微鏡を用いて細胞体全体にわたって取得され、3Dスタックの最大輝度投影として示されています。AFMと回転円盤共焦点顕微鏡画像の良好な重なりが確認できます。actin MRFPを導入した血管平滑筋細胞にAFMで機械的刺激を与え、回転円盤共焦点顕微鏡で撮像しました。

これらの誤差は、FM刺激によって顕著な再構成を示すアクチン線維を示しています。機械的刺激により、一部のアクチン線維は重合し、別の線維は脱重合し、さらに別のアクチン線維は束状になります。アクチンの再構成に基づき、EFMを用いて生細胞培養に機械的刺激を与えながら、光学イメージング法を用いて細胞骨格の再編成を同時に記録する方法を提示しました。

この手順を行う際は、FM実験が極めてノイズが多く、感度が非常に高いことに留意することが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験がうまくいくことを願っております。