Nailfold Capillaroscopyを使用して、毛細血管密度の定量のための再現性のコンピュータ化された方法
2015年10月27日
毛細血管鏡検査は、微小循環中の毛細血管を直接視覚化するための、非侵襲的で効率的で、比較的安価で習得しやすい方法論です。 しかし、これまでのところ、毛細血管鏡検査データの定量化に利用できる複雑なソフトウェアプログラムの信頼性について記述した論文は1件だけです。 ここでは、標準化されたアルゴリズムを使用してキャピラリーを定量するためのシンプルで信頼性の高いプロトコルを紹介します。
この手順の全体的な目標は、爪のキューティクルの真下の皮膚の領域の平方ミリメートルあたりの毛細血管の数を定量化することです。これは、最初にキューティクルの下の指の爪床のモノクロ写真を撮ることによって達成されます。2番目のステップは、画像をコンピューターイメージングプログラムにインポートすることです。
次に、画像が操作されます 毛細血管をよりよく視覚化するために、最後のステップは、1平方ミリメートル内のすべての毛細血管を特定してカウントすることです。最終的に、画像操作は、個人の毛細血管の量と形態を示すために使用されます。この方法は、高血圧、糖尿病、その他の疾患が微小循環にどのように影響するかなど、心血管分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。
モノクロデジタルカメラを使用して、前述のようにキャピラリー画像を取得します。次に、毛細管画像を取得するために使用したのと同じカメラと倍率イメージング条件を使用して、ミリメートルのマーキングで嘲笑のキャリブレーション画像を撮ります。嘲笑の画像をコンピューターイメージングプログラムにインポートし、定規の写真上の1ミリメートルの線のピクセル数を測定します。
この数値を書き留めて、1 ミリメートル x 1 ミリメートルの領域にあるピクセル数を計算します。次に、キャピラリー画像の1つを開き、キャピラリーを暗くし、ベストフィットヒストグラムを使用して画像を調整して背景を明るくします。次に、ドロップダウンメニューの[ROIの作成]コマンドを使用して、画面の上部に1ミリメートル×1ミリメートルの関心領域を作成します。
関心領域をドラッグして、最も明確なキャピラリーループのある位置に配置します。対象領域が、キャピラリーループの頂点が領域の最上部に位置するように配置されていることを確認します。プロトコールのこのステップの再現性と標準化の鍵は、1ミリメートル四方の関心領域ボックスの適切な配置です。
標準化を維持するための経験則は、ボックスを画像のキャピラリーループの頂点または先端に配置することです。正しく配置されたら、ROIをクリックし、表示されるドロップダウンメニューから[切り抜き]をクリックしてから、画像を平坦化して、今後のすべての画像調整が画像に均等に適用されるようにします。次に、画像のコントラストを 75 に上げて、毛細血管が最大限に視覚化されるようにします。
また、毛細血管のエッジを滑らかにするために、画像を斑点除去します。ヒストグラムを最適なモデルに調整して、キャピラリーが黒く、背景が白になるようにして、画像のコントラストを確定します。各画像で、プログラムによってカウントされるオブジェクトとして認識されるターゲットオブジェクト機能を使用して、明確に定義されたキャピラリーの一部を手動で選択します。
次に、カウントアルゴリズムで無視する必要がある領域への参照として背景機能を使用して、背景の小さな部分を選択します。カウントされるオブジェクトの最小直径を 5 ピクセルに設定して、バックグラウンド ノイズが毛細管としてカウントされないようにします。次に、カウント機能を使用して、画像内のすべての毛細血管を各個人の即座にカウントします。
より信頼性の高い評価を得るために、3 枚から 4 枚の画像まで平均を数えます。時間を節約するには、最初に [マクロの記録] を選択して、このビデオで実行および説明されている手順とプロセスに基づいてマクロに名前を付けて、1 つ以上の画像に対して特定の一連のプロセスを自動的に実行するマクロを作成します。次に、マクロの記録中に画像操作手順を実行します。
将来の画像でマクロを使用する場合は、[マクロの実行]をクリックするだけで、プログラムは記録された補正を目的の画像に自動的に適用します。ユーザー入力が必要な唯一の手順は、画像をトリミングする場所を選択することです。最適に処理された画像は30秒以内にカウントでき、キャピラリーとバックグラウンド、および個々のキャピラリーを互いに明確に区別できます。
最終的な拡張イメージを次に示します。この画像で決定された総数は、マスターすると1平方ミリメートルあたり54本の毛細血管でした。この手法を使用すると、20分以内に12枚の画像を定量化して操作できます。
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概要
キャピラロスコピー（毛細血管鏡検査）は、微小循環における毛細血管を可視化するための非侵襲的な手法です。本記事では、標準化されたアルゴリズムを用いて毛細血管を定量化するための信頼性の高いプロトコルを紹介します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 微小循環
- 毛細血管の可視化
- 心血管研究
背景
- キャピラロスコピーにより、毛細血管を直接観察することが可能です。
- これまでの研究では、毛細血管の定量化ソフトウェアに関する信頼性データが限られていました。
- この手法は、さまざまな疾患における微小循環を理解する上で極めて重要です。
- 毛細血管を定量化することで、高血圧や糖尿病などの病態に関する知見を得ることができます。
研究の目的
- 毛細血管定量のための簡便で信頼性の高いプロトコルを開発すること。
- 毛細血管の形態および数量に関する理解を深めること。
- 毛細血管解析における既存の手法の不備を解消すること。
使用方法
- キューティクルの下にある爪床のモノクロ画像を撮影する。
- 画像をコンピュータの画像処理プログラムに取り込む。
- 毛細血管をより明確に視覚化するために画像を調整する。
- 規定の領域（1 mm²）内の毛細血管を特定し、数を数える。
主な結果
- このプロトコルにより、毛細血管の正確な定量が可能になります。
- 画像処理によって、毛細血管の形態の視認性が向上します。
- この手法は、疾患が微小循環に及ぼす影響の研究に適用可能です。
- 得られた結果は、心血管研究や臨床現場に寄与します。
結論
- 開発されたプロトコルは信頼性が高く、容易に実施可能です。
- 本手法は、微小循環の理解に有用なデータを提供します。
- この方法は、さまざまな心血管疾患の評価に寄与します。
よくある質問
業界における重要性
コンピューター化された爪床毛細血管鏡を用いた毛細血管密度の標準化された定量化は、初期探索およびトランスレーショナル研究における再現性のある微小血管評価という極めて重要なニーズに応えるものです。本手法は、主観性とユーザーの疲労を軽減し、疾患モデリングやターゲットバリデーションに関連する微小循環の信頼性の高い定量的な評価を可能にします。その再現性と効率性は、心血管疾患および代謝性疾患のパイプラインにおける重要な局面での強固な意思決定を支援します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的活用
初期探索とターゲットバリデーション
- 疾患モデルにおける仮説検証のため、微小血管変化の客観的な定量化を可能にします。
- 標準化された微小循環指標を提供することで、機能的ターゲットのバリデーションをサポートします。
- 毛細血管密度の評価におけるオペレーターバイアスを軽減し、メカニズムのデリスキングを促進します。
- 血管および代謝研究における初期段階のポートフォリオ選別において、予測の信頼性を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 後続の化合物スクリーニングに向けた、バリデーション済みの再現可能な画像ベースのアッセイを調製します。
- 毛細血管密度の測定を標準化し、アッセイの再現性と拡張性を向上させます。
- 研究間および施設間での比較に適した定量的なアウトプットを提供します。
- 迅速な半自動解析を可能にし、ハイスループットスクリーニングへの対応を支援します。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 微小血管の定量化を疾患関連のエンドポイントと整合させ、トランスレーショナルなバイオマーカー開発を促進します。
- 一貫した測定プロトコルを可能にすることで、探索段階から前臨床検証までの連続性を提供します。
- 堅牢な微小循環データに基づいた、リスク調整後の開発進展に関する意思決定を支援します。
- 定量的な毛細血管指標を疾患表現型に結びつけることで、トランスレーショナルな曖昧さを軽減します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このコンピューター制御式毛細血管鏡検査法は、創薬から前臨床までの継続的なプロセスに組み込まれており、早期の仮説検証とトランスレーショナルなバイオマーカーの整合性の両方を支援します。
- 探索生物学：微小血管研究における再現性のある仮説検証およびパスウェイの解明を促進します。
- スクリーニング：アッセイ開発および化合物評価のための、標準化された定量的な毛細血管密度データを提供します。
- 分析：実験条件下での微小血管の変化について、客観的な統計的比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：微小循環が関連エンドポイントとなる場合に、in vitroからin vivoモデルまでのバイオマーカーの整合性と継続性をサポートします。
- 組織的な再利用：さまざまな疾患モデルや研究チームに適応可能な、拡張性のある半自動ワークフローを提供します。
運用およびエンタープライズへの影響
- 科学的価値：微小血管研究における予測の信頼性を高め、メカニズムに関する曖昧さを軽減します。
- 運用の価値：最小限のトレーニングで、標準化され再現性の高い迅速な定量化を実現します。
- 戦略的価値：堅牢で定量的なエンドポイントを提供することで、go/no-go判断の改善と資本効率の向上をもたらします。
- ポートフォリオへの影響：血管および代謝性疾患プログラムのリスク調整後の優先順位付けと推進を可能にします。
実施上の考慮事項
- デジタルイメージングおよび毛細管鏡検査の判定に関する基礎的な専門知識が必要です。
- モノクロデジタルカメラおよび互換性のある画像解析ソフトウェアへのアクセスが必要です。
- 再現性を確保するため、画像取得およびROI（関心領域）の設定について、チーム間での標準化が求められます。
- 微小循環が重要なエンドポイントとなる、さまざまな疾患モデルに適応可能です。
- 手動によるROI選択は変動要因となる可能性があるため、プロトコルの遵守に注意が必要です。
