ImageJのプラグインを使用して細胞の計数手順の自動定量化と分析

このプロトコルの全体的な目標は、デジタル解析ツールを使用して、懸濁液中または浸潤アッセイメンブレン内の移動中の細胞の正確なカウントを迅速に行うことです。このプロトコールは、研究者が一般的な技術やin vitro細胞運動アッセイに必要な細胞数を定量するのに役立ちます。この方法の主な利点は、複数のフィルターと解析ツールを含めながら、高速で正確な細胞数を提供できることです。

まず、顕微鏡の照明を最大に設定します。4倍対物レンズに切り替えて、位相コントラストフィルターが使用中であることを確認します。次に、顕微鏡ソフトウェア内で、画像キャプチャ設定をデフォルト値に設定します。

次に、標準的な血球計算盤を顕微鏡ステージに置き、画像量キャリブレーションステップの画像をキャプチャします。必要に応じて露光時間を調整します。ImageJの細胞濃度計算機の下で、画像を開き、画像寸法を取得ボタンをクリックします。

このアクションは、画像の幅と高さのテキスト ボックスに、ピクセル単位の画像解像度を入力します。次に、直線ツールを選択し、カーソルをクリックしてドラッグすることにより、血球計算盤の主p平方の全長にわたって直線を引きます。次に、Mキーを押して結果ウィンドウを表示します。

次に、長さ列の値をセル濃度計算機のp二乗の長さテキストボックスに入力します。次に、をクリックします 画像ボリュームを計算する ボタンをクリックして、画像のボリュームを画像ボリュームテキストボックスに出力します。最後に、[保存]ボタンをクリックして、プラグインのキャリブレーションを完了します。

サンプル分析では、10マイクロリットルの細胞を血球計算盤スライドの両チャンバーにロードし、細胞の内部が細胞膜よりも暗くなるように焦点を調整して、極ではなく細胞の中央断面内に焦点を合わせます。次に、細胞が露出オーバーにならないように、露出をさらに調整します。わずかに見える血球計算盤のラインは許容されます。

次に、血球計算盤の中央領域の重なり合わない画像を5〜10枚キャプチャします。各画像の解像度と倍率は、ボリューム キャリブレーション イメージの場合と同じである必要があります。次に、細胞濃度計算機で[Count Cells]をクリックし、ポップアップウィンドウでカウントするフォルダを選択します。

次に、サンプル番号の入力ボックスに、チャンバーごとに撮影された画像の数を入力し、[OK]をクリックします。プラグインはデータを収集するようになりました。詳細については、テキストを参照してください。まず、顕微鏡ソフトウェア内で、画像キャプチャ設定をデフォルト値に設定します。

解剖スコープのステージには、白一色の背景を使用し、ステージ上の光源、できれば2つの柔軟なLEDライトを使用します。次に、完成したマイグレーションアッセイメンブレンスライドをステージに置きます。ソフトウェアによって表示されるリアルタイム画像を見て、単一の膜の端がカメラの視野内にちょうど来るように倍率を手動で調整します。

次に、光源の位置と露光時間を調整して、理想的な画像をできるだけ忠実に再現します。背景色が最小限に抑えられ、膜が均一に照らされています。細胞計数の精度は、高品質の画像取得にかかっています。

したがって、プラグインを最も効率的に使用するには、ユーザーのカメラで達成可能な最高の画像をキャプチャすることが重要です。次に、スライドを取り外し、顕微鏡ソフトウェアで画像をホワイトバランスしてキャリブレーションを完了します。イメージングの直前に、カバースリップに圧力を加えて各メンブレンを平らにし、閉じ込められた気泡をできるだけ多く取り除きます。

次に、ソフトウェア内で、キャプチャフォルダの場所を設定します。次に、メンブレンごとに 1 つの画像をキャプチャし、サンプル 001 の命名規則を使用して画像ファイルを TIF として保存し、各画像の数を増やします。この命名規則は、プラグインがファイルを見つけるために必要です。

フラットフィールド補正が必要な場合は、スライドごとに空白の領域を見つけて空白の画像を撮ります。ファイルをサンプル名空白として保存します。次に、ImageJでTCプラグインを開きます。

TC内でFlatfieldボタンをクリックし、Choose Directoryダイアログボックスからメンブレン画像を保存したフォルダを選択します。次に、移行アッセイメンブレン画像を開き、Color Thresholdを選択します。ウィンドウで、メソッドを Shanbhag に設定します。

しきい値の色を白に設定します。色空間をRGBに設定し、暗い背景オプションのチェックを外します。次に、上部のスライダーを 0 に、下部のスライダーを 255 に調整して、画像を完全に白くします。

白くなったら、原子核だけが見えるまで緑と赤のスライダーを調整します。TC プラグインで、RGB スライダーの値を、関連する構成設定の RGB しきい値テキスト ボックスにコピーします。次に、[追加/変更] ボタンをクリックして、設定を上書きします。

構成設定パネル内で、[保存] をクリックして設定をハード ドライブに書き込みます。次に、TCプラグインで画像をカウントするには、[Count Folder]をクリックして、カウントするフォルダを選択します。その後、プログラムは画像を処理し、データをメインテーブルに自動的に追加します。

さて、メインテーブルで、キャリブレーションにチェックマークが表示されますか?画像内の列には、理想的なメトリックとの類似性に基づいてキャリブレーションのフラグが付けられます。キャリブレーションのフラグが付けられたすべてのサンプルを選択します。

次に、右クリックして[再カウント]と[推奨サイズ]を選択します。これにより、推奨される最小粒子面積で画像が再カウントされます。次に、もう一度右クリックして[プロットの表示]を選択します。

理想的な画像には、長い右裾正規分布に似たグラフがあります。必要に応じて、サンプルを選択して右クリックし、[再カウント]と[手動設定]を選択して、小さいサイズ範囲またはRGBしきい値の設定を調整します。次に、必要な設定を入力し、[カウント]をクリックして画像を再カウントします。

カウントを手動で調整するには、サンプルを選択し、テーブルを右クリックして、[カウントで画像を開く] を選択します。元の画像は、プラグインによってカウントされた各パーティクルを表す赤いマークで開きます。さらに、[カウントされたバイナリ画像を表示]オプションを使用して、個々のセルが色のしきい値によってどの程度適切に解決されているかを確認できます。

カウントを手動で追加するには、Control キーを押しながら左クリックします。これにより、カーソル位置にマーカーが追加され、合計カウントに追加されます。マーカーを手動で削除するには、画像を右クリックすると、プラグインがカーソルに最も近いマーカーを削除します。

マーカーのグループを削除するには、関心のある領域を選択し、Control キーを押しながら領域を右クリックします。細胞濃度計算機のプロセスは、p-squareキャリブレーション画像とp-squareの長さとピクセルの計算に依存します。血球計算盤のp平方の体積は100ナノリットルであり、この定数を考えると、ピクセルをミリメートルに変換した後に総画像体積を計算できます。

さまざまな実験や細胞タイプから採取した57枚の画像について、手動と自動のカウントを比較すると、両手法の間には非常に密接な相関関係があることがわかります。ミリリットルあたり500万から2,000個の細胞の濃度が、自動化されたプロセスを使用して正確にカウントされました。メトリック Q は、異なる粒子サイズの分布に基づく全体的な画像の鮮明さを表します。

適切な Q が 0.5 より大きい。これらの修飾子を、明るさとバックグラウンドノイズに関して中程度の画像から優れた画像の選択に適用したところ、キャリブレーションされた画像カウントは、キャリブレーションされていない画像カウントよりも手動カウントに有意に近かった。このビデオを見れば、CCCおよびTC ImageJプラグインを使用して、懸濁液中の細胞および細胞運動性アッセイから細胞を正確かつ効率的にカウントする方法を十分に理解できるはずです。

TCプラグインを習得すると、セルカウントの取得、定量化、調整を1時間以内に行うことができます。どちらのプラグインも ImageJ のパーティクル カウント機能に依存しており、ImageJ で使用されるマクロを編集することで変更できます。これにより、ユーザーはプラグインの範囲を他のパーティクルに拡大する柔軟性が高まります。