ハイスループットスクリーニングを使用したキナーゼ基質ペアの同定

この手順の全体的な目標は、ハイスループットスクリーニング法を使用して、目的の基質をリン酸化するキナーゼを同定することです。これは、まず、キナーゼFUをグルタチオンに発現するプラスミドをトランスフェラーゼまたはGSTとして細胞にトランスセクトすることによって達成されます。2番目のステップは、GSTキナーゼプルダウンを実行することです。

次に、サンプルをゲルにロードし、ゲルを走らせてkumasi brilliant blue dyeで染色します。最後のステップは、ゲルを乾燥させ、自動X線撮影フィルムにさらすことです。最終的には、得られたフィルムを現像し、解釈することにより、各レーンが異なるキナーゼアッセイを代表するため、キナーゼ基質ペアを同定することができます。

既知のリン酸化基質のキナーゼを同定する既存の方法には、バイオインフォマティクスアプローチを使用して基質中のコンセンサス部位を探索する方法、生化学的手法を使用してキナーゼと基質との間の複合体を検出する、試行錯誤アプローチ、既知の生物学的機能に基づいてコンセンサス基質を探索する方法などがあります。これらのアプローチは時間がかかり、常に成功するとは限りません。私たちのアプローチにより、機能的結果に基づいてキナーゼ基質ペアを迅速に同定することができます。

この方法を最初に思いついたとき、in vitroでの特異性が不十分ではないかと懸念していました。結局のところ、基質特異性は優れており、スクリーニング内の特定の基質をリン酸化できるのはファミリーメンバーキナーゼのみであることがしばしば見つかります。これは、各スクリーンで複数の基質を使用してマルチプレックス化する場合に特に明白であり、手順が私の研究室の技術者であるCourtneyであることを示していますテキストプロトコルに記載されているように、試薬、プレート、および細胞の調製から手順を開始します。

キナーゼプラスミドを含むプレートを凍結した場合は、室温で解凍し、1900 倍の G で 3 分間遠心分離して、ウェルの底に水分を回収します。8.6ミリリットルの還元血清培地と312.7マイクロリットルの脂質ベースのトランスフェクション試薬を混合し、混合物を各ウェルに5分間放置します。キナーゼプラスミドを含有する96ウェルプレートのうち、10マイクロリットルの還元血清培地。

小容量カセットを装着した自動液体ディスペンサーを使用し、次に少量カセットを装着した自動液体ディスペンサーを使用して、ウェルあたり10マイクロリットルの還元血清中トランスフェクション試薬ミックスを添加し、プレートを20〜45分間放置します。次に、2 93 T細胞を80ミリリットルの完全デルコス修飾液中に75万細胞/ミリリットルで懸濁し、中程度またはDMEMをウェルあたり100マイクロリットルの細胞懸濁液で還元する。標準容量のカセットを取り付けた自動液体ディスペンサーを使用して、顕微鏡でウェルの細胞分布が均一であることを確認してから、プレートを摂氏37度のインキュベーターに24時間戻します。

GSTキナーゼプルダウン実験を開始します。2番目のチューブに60マイクロリットルの0.2モルバナジン酸ナトリウムと540マイクロリットルの水を混合し、2.7マイクロリットルの30%過酸化物と1.4ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水またはPBSを混合することにより、バナジン酸溶液あたり4ミリモルを作成します。2つの溶液を一緒に加え、混合物を15分間放置してから使用します。

マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルに2マイクロリットルの0.25モル塩化カルシウムを分注し、続いて2.5マイクロリットルの証明済みデーツ溶液を分注します。各プレートを摂氏37度で10分間インキュベートし、プレートを氷の上に置いたまま氷の上に置きます。氷冷溶解バッファーのウェルあたり50マイクロリットルの真空剤を直ちに使用して、各ウェルから培地を取り出します。

標準カセットに付属している自動液体ディスペンサーを使用して、プレートを氷の上に30分間置いてシラミを刺します。プレートを1900倍Gで摂氏4度で3分間回転させた後、マルチチャンネルピペットを使用して各ウェルから細胞をこすり落とし、すべての内容物を適切に標識されたvboに移します。96ウェルプレートは、氷冷溶解緩衝液のウェルあたり100マイクロリットルでグルタチオンコーティングプレートを充填しながら、摂氏4度で摂氏4度で1900倍Gでプレートを回転させます。

すすぎとして、プレートを氷の上に置いておきます。底板を遠心分離した後、グルタチオンプレートをシンクの上で反転させて溶解バッファーを振り落とし、ペーパータオルでブロットします。V底板からグルタチオンプレートに溶解バッファーを移し替えるには、プレートを傾け、マルチチャンネルピペットを使用し、底面のペレットを乱さないように注意します。

次に、プレートを覆い、氷の上に最低2時間放置します。2時間の結合ステップの終わり近くで結合するには、放射能作業に必要な安全対策が講じられていることを確認する放射能ワークステーションを準備します。ハイブリダイゼーションオーブンを摂氏30度に設定します。

グルタチオンプレートをシンクの上で反転させて溶解バッファーを振り落とし、ペーパータオルでブロットします。PMSFを含まない100マイクロリットルの溶解バッファーでウェルを3回すすぎます。井戸を乾いたままにしないでください。

続行する準備ができるまで、それらをすすぎに置いておきます。次に、テキストプロトコルに記載されているように、55ミリリットルのXキナーゼバッファーまたは1つのx kbを調製します。標準容量のカセットが取り付けられた自動液体ディスペンサーを使用して、プレートの各ウェルに50マイクロリットルの1 x kbを加えます。

次に、テキストプロトコルに詳述されているように、目的の基質とミエリン塩基性タンパク質またはMVPを含む溶液を一度に1つずつ作製することにより、溶液Aを調製します。シンクの上でプレートをひっくり返して、ペーパータオル上の1つのXKBリンスプロットを取り外し、すぐに溶液A.小容量カセットを取り付けた自動液体ディスペンサーを使用して30マイクロリットルを追加します。プレートを氷の上に保ちます。

次に、テキストプロトコルに記載されているように、放射能作業領域で溶液Bをウェルあたり20マイクロリットルの溶液Bで調製します。吐出力による混合を助けるリピーターピペットを使用して、プレートを摂氏30度のハイブリダイゼーションオーブンで30分間インキュベートします。30分後、プレートを氷に戻します。

次に、マルチチャンネルピペットを使用して、2 x エクル硫酸ナトリウムまたはSDS溶解バッファーを50マイクロリットルを各ウェルに加えます。このセクションのすべての作業は、無線活動のために指定されたエリアで実行する必要があります。ハイブリダイゼーションオーブンの電源を入れ、摂氏85度に設定します。

オーブンの温度に達したら、プレートをオーブンに移し、10分間インキュベートしてサンプルを変性させます。次の読み込み。各反応の15マイクロリットルを含む26ウェルプレキャストゲル。

マルチチャンネルピペットを使用して一度に複数のウェルを充填する場合は、すべてのチップが対応するウェルと揃うように注意する必要があります。サンプルを添加する前に、ゲルを150ボルトで泳動します。青い線がゲルの底から流れ出さないようにしてください。これには未取り込まれのA TPが含まれています。次に、ゲルを分解し、フィルム上のゲルの露出が暗くなるため、組み込まれていないTPを取り外します。

ラベル付きの容器にゲルを入れ、クマシ染色剤で15分間覆います。次に、クマシの汚れを落とします。ゲルを水で短時間すすぎ、デテン液を加えます。

タンパク質がはっきりと見えるまでゲルを留置します。MVPのバンドと基板のバンドは、各サンプルで見える必要があります。ゲルを乾燥させるには、大きな濾紙をカットして乾燥機の上に置きます。

セロハンシートを蒸留水で滑らかでしわがなくなるまで濡らし、紙の上に置きます。セロハンシートの上にゲルを置き、ゲルの順序をメモします。2枚目のセロハンシートを濡らし、ジェルの上に置きます。

すべての泡をロールアウトして、表面を均一にします。フラップを閉じ、バキュームをオンにして、ゲルを摂氏80度で3時間駆動します。ゲルが乾いたら、スクリーンを使用してダブルエマルジョン自動X線撮影フィルムに溶かし、シグナルを強めます。

カセットをサランラップまたはビニール袋で包み、霜が入らないようにテープで密封してから、カセットを摂氏マイナス80度で一晩保管してください。翌日、カセットを冷凍庫から取り出し、室温で解凍します。フィルムは、製造元の指示に従って、フィルムプロセッサーを使用して暗室で現像します。

以下は、クレブ制御転写コアクチベーター2またはC RTC 2のアミノ酸268〜283に対応するA GSTタグ付きペプチド基質、ならびに古典的なキナーゼアッセイ基質であるミエリン塩基性タンパク質またはMBPのみの2を用いてスクリーニングしたスクリーニングの代表的な結果である。キナーゼはマーク2であり、関連性の高いキナーゼはリン酸化されるマーク3です。CRTC 2ペプチドMBPは、多くのホスホリル関連残基を含み、ゲルの底に向かって18キロダルトンで流れるため、すべてのアッセイで内部コントロールとして含まれています。

これにより、特異性の解釈が可能になります。一部のキナーゼは、基質とMVPを強力にリン酸化します。ここで注目すべきは、GSTのみを含むウェルは、常に内因性キナーゼ活性を精製することです。

したがって、アッセイには常にバックグラウンドリン酸化があります。これは、基質のリン酸化が本物であることを排除するものではありませんが、in vitroの設定では、キナーゼの選択性が低い可能性があることを示唆しています。キナーゼ基質特異性に関する結論を導き出すために、分子量の異なる複数の基質を含めることは特に有益です。

スクリーニングはin vitroであり、in vivoではさらに複雑なレベルが発生するため、候補キナーゼは細胞内でバリデーションする必要があります。例えば、候補キナーゼは、in vitroで基質をリン酸化する能力を有していてもよく、それは基質と同じ細胞型またはコンパートメントの同じ亜細胞では発現しない。これは通常、RNAiを介した候補のサイレンシングを使用して行われます。

、基質の非リン酸化性関連変異体を用いて二次スクリーニングを行い、特異性を確認することも可能です。