リン酸化部位決定のためのオリゴペプチド競合アッセイ

この手順の全体的な目標は、複数の潜在的なリン酸化部位を同時に評価し、その後のリン酸化部位変異体による検証のための部位を特定することです。この方法は、細胞シグナル伝達における翻訳後修飾の役割に関する生化学および細胞生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術により、リン酸化部位や目的のタンパク質について、予算に見合った予備スクリーニングが容易になります。

この技術の意味は、リン酸化がヒト疾患のシグナル伝達経路における重要な生化学的事象であるため、炎症や癌などの疾患の診断と治療にまで及びました。デモンストレーションを支援するのは、私の研究室の大学院生であるSol-Bi Shinで、サイト指向突然変異誘発を行っています。まず、50ナノグラムの血漿pGEX JST NRF2、125ナノグラムのフォワードプライマー、125ナノグラムのリバースプライマー、1マイクロリットルのDNTPミックス、2.5ユニットのPFU DNAポリメラーゼ、および10x反応バッファーを氷上に組み合わせます。

滅菌蒸留水を追加して、容量を50マイクロリットルにします。PCRを実施して変異体鎖を組み込み、サンプルを氷上で2分間冷却します。冷却したサンプルに1マイクロリットルのDPNI制限酵素を加えます。

穏やかなピペッティングでサンプルを混合し、その後、親の二本鎖DNAを消化するために37°Cで2時間サンプルをインキュベートするために1分間、13、000回でサンプルを遠心分離します。次に、endA1およびRACA1変異を持つスーパーコンピテント大腸菌細胞を氷上に投げます。50マイクロリットルの反応混合物を冷却した細胞に加え、氷上で30分間インキュベートします。

その間、加熱ブロックを摂氏42度に予熱します。インキュベーションが完了したら、混合物を摂氏42度で90秒間加熱し、次に混合物を氷上で2分間冷却します。予熱したLysogenyブロスを形質転換細胞に加えます。

混合物を摂氏37度で1時間インキュベートし、180RPMで振とうします。次に、LBアンピシリン寒天プレート上に細胞を広げ、プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。単一のコロニーをアンピシリンを含む5ミリリットルのLysogenyブロスに移します。

サンプルを摂氏37度で一晩インキュベートし、180 RPMで振とうします。DNA配列解析用の標準的なミニ調製キットを使用して、サンプルDNAを抽出します。DNAアナライザーで少なくとも200ナノグラムのHDNAコンストラクトを実行し、変異体配列を確認します。

検証済みの変異型NRF2タンパク質を発現および精製します。キナーゼアッセイを進める前に、産生される変異型NRF2の量を決定します。ペプチド競合アッセイを開始するには、アデノシン一リン酸濃度が500マイクロモルの5Xキナーゼ緩衝液を調製します。

次に、AMPK野生型ヒトNRF2の凍結サンプルと、NRF2のAMPKリン酸化部位を模倣した3つのオリオゴペプチドを解凍します。各ペプチドについて、氷上で0.43ミリグラムのペプチドを0.15マイクログラムのAMPK、0.4マイクログラムのNRF2、および6マイクロリットルの5Xキナーゼバッファーと組み合わせます。滅菌蒸留水を加えて、最終容量を30マイクロリットルにします。

次に、シールドエリアで、加熱ブロックを摂氏30度に設定します。各チューブにγ 32P ATPのマイクロキュリーを1つ加え、ピペッティングで上下させて各溶液を完全に混合します。反応混合物を摂氏30度で15〜30分間インキュベー

インキュベーション中に、7.5%STS PAGEゲルを調製します。次に、3マイクロリットルの10X STSサンプルバッファーを各チューブに加え、完全に混合してキナーゼ反応を停止します。ゲル内のサンプルを70ボルトで20分間、次に140ボルトで1時間分析します。

ゲル電気泳動が完了したら、ブロモフェノールのブルーラインの下にある高放射性ゲルを慎重に除去します。ゲルをキャスターからガラス管にそっと移します。ゲルを50%メタノール、40%水、10%酢酸の溶液に20分間固定します。

次に、ジェルを濾紙の上にそっと置き、透明なラップで覆います。ゲルを真空ゲルドライヤーで摂氏80度で1時間乾燥させます。ドライゲルをリンスクリーンまたはX線フィルムにそれぞれ約16時間、2日間さ

フォスフォイメージャーを使用して、画面の高解像度のTIFFまたはビットマップファイルを生成します。AMPK活性アッセイを開始するには、AMPKおよび変異型および野生型GST NRF2のサンプルを氷上で解凍します。0.4マイクログラムの変異型GST NRF2を0.15マイクログラムのAMPKおよび6マイクロリットルの5Xキナーゼバッファーと組み合わせます。

滅菌蒸留水を追加して、容量を30マイクロリットルにします。この方法で、0.4マイクログラムの野生型GST NRF2と別の反応混合物を調製します。各反応バイアルにγ 32P ATPのマイクロキュリーを1つ加えます。

混合物を数回ピペットで上下させてから、混合物を短時間遠心分離します。混合物を30°Cで30分間インキュベートし、シールド領域でインキュベートした後、3マイクロリットルの10X STSサンプルバッファーでキナーゼ反応を終了します。STS PAGEを実行し、ゲルを固定し、競合するキナーゼアッセイと同じ条件でゲルを乾燥させます。

ゲルをリンスクリーンに一晩さらし、Phosphorimagerでスクリーンをスキャンします。in vitro AMPKアッセイは、ヒトNRF2上のAMPKリン酸化部位を模倣する3つの10残基オリゴペプチドの存在下で実施しました。Serine 558 サイトを模倣したオリゴペプチドは、AMPK リン酸化の最大の競争相手でした。

次に、Serine 558をアラニンに置換したNRF2変異体を合成し、in vitro活性アッセイで評価しました。S558 A変異体のAMPKリン酸化はほとんど観察されず、AMPKがセリン558でヒトNRF2を直接リン酸化することを示しています。ペプチドはタンパク質に競合的に結合するため、この方法の原理は、アセチル化残基やリジン残基、タンパク質タンパク質相互作用などの他の翻訳後および修飾の同定にも適用できます。

放射性同位元素の取り扱いは非常に危険であることを忘れないでください。この手順を実行する前に、放射性同位元素の安全トレーニングをすでに受けておく必要があります。