細菌人工染色体：プラス鎖RNAウイルスの研究のための機能ゲノミクスツール

この手順の全体的な目的は、日本脳炎ウイルスのように、ゲノムが細胞内mRNAと同じ極性を持つプラス鎖RNAウイルスのクローンcDNAから、感染性ウイルス粒子を回収することです。このcDNAに基づくリバースジェネティクスは、ウイルスゲノムRNAの直接的な操作を可能にする画期的な手法であり、これによりウイルスの複製や病原性の分子遺伝学的研究のための組換えウイルスを生成することができます。また、この技術は、外来遺伝子を導入するための遺伝学的に定義されたワクシニアウイルスベクターの開発を可能にする貴重なプラットフォームを提供します。

これらの手法は、陰性または陽性株、および特に10 kb以上のゲノムを持つRNAウイルスのフルレングスcDNAクローニングに適用可能です。本手順の実演は、私の研究室のメンバーであるリサーチアシスタントのSang-Im Yun、ポストドクターのByung-Hak SongとJin-Kyoung Kim、および学部生のJordan Frankが行います。

本出版物のビデオパートでは、目的の配列を含む細菌人工染色体（BAC）の調製、バックプラスミドから転写されたRNAの合成、およびRNAの感染性とウイルス収量の測定方法について解説します。BACプラスミドを作成する前に行うすべての手順は、テキストプロトコルに詳細に記載されています。本手順では、まず BACプラスミドを保持する E. coli DH10B の単一コロニーを、クロラムフェニコールを含む 3 mL の 2X YT ブロスで培養します。この培養物を 35 °C で、225 ～ 250 RPM で振盪しながら 10 時間インキュベートします。

10時間後、培養をスケールアップします。次に、500 µLの培養液を500 mLの培地に接種し、激しく振盪しながら6時間培養します。6時間後、細菌培養液を250 mLボトル2本に入れ、4°Cで3,100 g、15分間遠心分離します。その後、各ペレットを30 mLのGTE溶液で再懸濁します。

リゾチームを500 µL加え、懸濁液を氷上で10分間インキュベートします。その間に、次のステップで使用する新鮮な溶解液を準備します。10分後、溶解液を60 mL加え、溶液が透明になるまで旋回混和します。

室温で10分間反応させます。次に、各ボトルに45 millilitersの中和溶液を加え、十分に混ざるまでボトルを転倒混和させます。その後、氷上で10分間静置します。

高gの冷却遠心分離により、中和されたライセートを回収します。次に、上清を2本の新しい250 mLボトルに回収します。それぞれに0.6体積の100%イソプロパノールを加え、氷上で20分間静置します。

次に、沈殿物を遠心分離して回収し、上清を捨てて、ペレットを5 mLのTEバッファーに溶解します。2つの液量を1本の50 mLチューブにまとめ、等量の5 M塩化リチウムを加えて混合物を氷上で10分間インキュベートし、RNAを沈殿させます。20分間の冷却遠心分離を行い、RNA沈殿物を回収します。

次に、上清を新しい 250 milliliter チューブに移し、2倍量の 100%isopropanol を加えてチューブを氷上に置き、DNAを沈殿させます。20分後、遠心分離で沈殿物を集め、上清を吸引除去し、DNAペレットを 9.5 milliliters のTE buffer で再懸濁させ、DNA溶液を 50 milliliter チューブに移します。

エチジウムブロミドを用いた塩化セシウム密度勾配を調製し、準備を続けます。18ゲージの針を装着したシリンジを用いて、混合液を密封可能なポリプロピレンチューブに充填し、チューブを密封します。密封したチューブを超遠心機で一晩回転させ、塩化セシウム密度勾配を形成させます。

翌日、塩化セシウム密度勾配からBACプラスミドのDNAバンドを回収します。18Gの針を用いて勾配の上部に空気抜き穴を作り、20Gの針とシリンジを用いて勾配の側面からBAC DNAを回収し、回収物を1.7 mLマイクロ遠心チューブに移します。洗浄を行うため、2.5容量分の飽和ブタノール水を加え、通常通りボルテックスで混合します。

次に、混合液を室温で遠心分離し、下層の水相を新しい1.7 milliliterのマイクロ遠心チューブに移します。エチジウムブロマイドを完全に除去するため、この洗浄操作を計6回繰り返します。続いて、BAC DNAを沈殿させます。チューブに、液量の1/10量となる3 molar酢酸ナトリウムと、2.5 volumesの100% ethanolを加えます。混合液を氷上で10分間インキュベートします。その後、沈殿物を室温で遠心分離し、DNAペレットを1 milliliterの70% ethanolで洗浄します。再度遠心分離を行い、ペレットを回収します。最後に、ペレット化したDNAを10分間風乾させ、200 microlitersのTE bufferで溶出させます。

まず、合計100 µLの液量で、Xba-oneを用いてBACプラスミドの大スケール制限酵素消化を行います。この消化反応を37 °Cで12〜15時間実施します。次に、さらに25 unitsのムング豆ヌクレアーゼを加え、30 °Cで2時間追加でインキュベートします。

インキュベーション後、蒸留水を用いて液量を300 µLまで調整します。次に、希釈したサンプルに等量のフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールを加え、1分間激しくボルテックスし、チューブを遠心分離して上層の水相を新しいチューブに移すことで、フェノール抽出を行います。

次に、クロロホルムを用いて抽出を繰り返します。続いて、エタノール沈殿により直線化したBAC DNAを回収します。遠心分離でDNAペレットを回収し、上清を捨てて、1 mLの70%エタノールでペレットを洗浄します。再び遠心分離を行い、ペレットを風乾させます。10分間乾燥させた後、DNAペレットを30 µLの蒸留水に溶解させます。その後、回収したBAC 1 µLを0.8%アガロースゲルで確認します。

次に、RNA定量用のトリチウム標識UTPを含め、線状化したBAC DNAを用いて25 µLのランオフ転写系を構築します。反応を37 °Cで1時間行います。その後、ランオフ転写反応液の1〜2 µLを0.6%アガロースゲルで確認します。

150 mmディッシュに1枚あたり3 million cellsで播種し、24時間培養したBHK-21細胞を用います。細胞単層を冷たい溶液Aで洗浄し、トリプシン処理により細胞を剥離させます。270 gで2分間遠心分離し、細胞を回収します。

次に、細胞を50 millilitersの冷えた溶液Aに再懸濁し、再度遠心分離します。この洗浄操作を3回繰り返します。最後の洗浄後、細胞を溶液Aを用いて20 million per milliliterの濃度で再懸濁します。その後、細胞懸濁液の400 microliter分注量を、2 microgramsの合成RNAとともに2 millimeterキュベット内で混合します。

最適な条件下で速やかに混合液をエレクトロポレーションし、細胞を10分間静置させる。次に、細胞を600 µLの完全培地を含むマイクロ遠心チューブに移す。続いて、エレクトロポレーション後の細胞を1 mL量で10倍段階希釈して調製する。各希釈液を100 µLずつ、BHK21細胞のモノレイヤー上に播種する。4〜6時間インキュベートした後、FBS添加MEMに0.5%アガロースを加えたものを細胞の上に重層し、さらに4日間培養する。

BHK21細胞を、モック電極導入するか、あるいはフルレングスのJEV-BACの2つの独立したクローン由来のRNA転写物を電極導入した。4日後、細胞をクリスタルバイオレットで染色し、細胞内の感染性RNAを観察した。この染色を用いて、感染中心（infectious centers）を定量化した。次に、RNA電極導入後の20時間において、抗NS1ウサギ抗血清および赤色に見えるCy3結合二次抗体を用いて、ウイルス蛋白の発現を調べた。核は青色に見えるDAPIで対比染色した。その後、導入後22時間および40時間において、RNA電極導入細胞の培養上清に蓄積した感染性ビリオンの産生量をプラークアッセイにより調べた。

このビデオを視聴することで、日本脳炎ウイルスなどの陽性株のクローニングされたcDNA、またはRNAから、感染性ウイルスを完全にレスキューする方法について深く理解することができます。日本脳炎ウイルスやその他のヒト病原体を扱うことは非常に危険であることに留意してください。この手順を実施する前に、適切なバイオセーフティトレーニングを受ける必要があります。