ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いた環境ウイルスのコミュニティから一本鎖DNA、二本鎖DNAとRNAの分離

このビデオでは、核酸組成に基づいて混合ウイルス集団を分離する手順を解説します。これにより、複雑なウイルス集団の分類学的多様性と機能的ポテンシャルの研究が可能になります。ここでは、リン酸カルシウムの結晶形態であるヒドロキシアパタイトを用いて核酸の分離を行います。

まず、ヒドロキシアパタイトカラムを充填して平衡化させ、その後、精製したウイルス核酸をカラムに適用します。ヒドロキシアパタイトの正に帯電したカルシウムイオンと、核酸サブタイプの負に帯電したリン酸バックボーンとの間の電荷相互作用により、核酸がカラムに結合します。次に、単鎖DNA・RNAおよび二本鎖DNAを、異なる濃度のリン酸バッファーを用いて順次溶出させます。得られた核酸を脱塩および濃縮し、可視化、定量化、およびDNAシーケンシングによる同定の準備を行います。アガロースゲル電気泳動により、核酸種が9%未満のキャリーオーバーで分離できることが確認されます。

このように、本手法によりウイルスコミュニティの多様性と機能的能力の評価が可能になります。こんにちは、私はDoug Froです。j Craig Venture InstituteのShannon Williamson博士の研究室でリサーチアソシエイトを務めています。本日は、環境ウイルス集団から一本鎖DNA、二本鎖DNA、およびRNAを分離する手順について解説します。

本手法は、DNAまたはRNAのいずれかを標的とする核酸抽出などの既存の手法と比較して利点があります。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、ウイルスコミュニティ全体を捕捉することが可能です。この手法を用いることで、ウイルス生態学の分野におけるいくつかの疑問を解決することができます。

例えば、総遺伝子組成やウイルスコミュニティの多様性はどのようなものか、といった点です。私たちは、遺伝的シグネチャーの一部を犠牲にすることなく、チェサピーク湾のリオプランクトン群集全体を研究したいと考えた際に、まずこの方法を思いつきました。この実験に必要な溶液は、付属の書面プロトコルの指示に従って事前に調製しておく必要があり、0.12 molar リン酸緩衝液、0.20 molar リン酸緩衝液、0.40 molar リン酸緩衝液、および 1 molar リン酸溶液が含まれます。

すべてpH 6.8とし、実験当日に、すべてのリン酸緩衝液と水和ヒドロキシアパタイトを60 °Cのウォーターバスに置いて平衡化します。まず、ウイルス核酸の分離に使用するエコノカラムを準備して、この手順を開始します。エコノカラムの端にストップコックを取り付け、それが閉じていることを確認してください。

ピペッターを用いてカラムに脱イオン水を加え、カラム上部にキャップを閉めて、カラムを繰り返し反転させて洗浄します。水を捨て、この洗浄工程を数回繰り返します。次に、econカラムからストップコックを取り外し、オートクレーブで滅菌します。

ストップコックは溶けるため、オートクレーブ処理しないでください。ストップコックをイオン水で洗浄し、次に70%エタノールで洗浄した後、オートクレーブ後の乾燥まで自然乾燥させてください。ストップコックを取り付け、閉じます。

次に、ドラフトチャンバー内で、Sigma Coatを1 mLカラムに加え、ここで示すようにカラムを回転させながら反転させて、カラムのガラス面をコーティングします。Sigma Coatでコーティングすることで、核酸のガラス表面への吸着を最小限に抑えることができます。分画の間、ガラス表面がコーティングされた状態になります。

ストップコックを開き、コニカルチューブにデカンテーションします。次に、カラムを循環水槽に接続するため、2つのクランプを使用してカラムをリングスタンドに固定します。循環水槽からシリコンチューブを接続し、水槽からの水の流れが下から上に向かうようにします。

温度を60 °Cに設定し、循環を開始します。実際には、熱損失を最小限に抑えるため、カラムとチューブをアルミホイルやフォーム管絶縁材などの断熱材で包みますが、この手順はここでは省略しています。

手順をより明確に視覚化するため、ストップコックを閉じます。ピペッターを用いて、滅菌済みのRNaseフリー水を10 milliliters加えます。ストップコックを開き、水を排出させます。

次に、2回目の洗浄に従って再度洗浄します。10 millilitersの滅菌済みRNase free 0.12 molar リン酸緩衝液で2回リンスし、洗浄ごとに液を捨てます。これで、カラムはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに使用できる状態になります。

econカラムのストップコックが閉じていることを確認します。次に、滅菌済みの2 mLセロロジカルピペットを用いて、調製した再懸濁済みの再水和ヒドロキシアパタイト2 mLをカラムの底部にゆっくりと加えます。カラムキャップを戻します。

ヒドロキシアパタイトを重力下で30分間静置させます。この手法では細部への注意が必要です。ヒドロキシアパタイトカラムの処理速度は0.25〜0.5 mL/minです。

したがって、カラムが乾燥しないよう注意深く監視することが非常に重要です。30分後、ストップコックを開いてバッファーを廃棄容器に排出します。ストップコックを閉じ、フロースルーを廃棄してください。

核酸を0.12 molar リン酸緩衝液で最終容量500 µLとなるように混合し、60 °Cで10分間インキュベートします。これにより、核酸をカラムの温度に平衡化させ、存在する可能性のある二次構造を除去することで、異なる核酸種の分離能を高めることができます。2 mLのセロロジカルピペットを用いて、カラムを乱さないように注意しながら、核酸溶液をヒドロキシアパタイトに迅速に適用します。

500 µLすべてがカラムに流入したら、カラムの乾燥を防ぐために少量の0.12 M リン酸バッファーをカラム上部に加えます。核酸をヒドロキシアパタイトに30分間結合させます。結合インキュベーションの後、カラムの下に15 mLコニカルチューブを設置します。

次に、ストップコックを開き、単鎖DNAを含む最初の500 µLのサンプルを回収します。500 µLの回収が完了したら、ストップコックを閉じます。続いて、カラムを乱さないように注意しながら、ヒドロキシアパタイトに0.12 Mのリン酸緩衝液を6 mL加えます。

次にストップコックを開き、前ステップと同じ15 milliliterチューブに、シングルストランドDNAを含むフロースルーを回収し続けます。約6 milliliters回収した後、ストップコックを閉じます。チューブに1容量分のフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール溶液を加え、ボルテックスミキサーで激しく混合し、その後3,500 ×gで15分間遠心分離します。

遠心分離後、チューブ内は2層に分かれます。一本鎖DNAを含む上層を新しい15 milliliterチューブに移し、室温で保存します。カラムからRNAを溶出・精製するために、0.20 molarリン酸緩衝液を6 milliliters加え、新しい15 milliliterチューブを用いてフロースルーを回収します。その後、フェノール・クロロホルム抽出を行います。

一本鎖DNA試料については、6 mLの0.40 Mリン酸緩衝液を用いてこの工程を繰り返し、カラムから二本鎖DNAを溶出および精製します。最後に、カラムに残存する二本鎖DNAを完全に除去するため、この工程をもう一度繰り返します。

今回は、核酸サンプルの脱塩に1.00 Mのリン酸緩衝液を6 mL使用します。各サンプル4〜5 mLを、分画分子量30,000のウルトラセル膜を備えたUltra-4遠心フィルターデバイスに移します。固定角ローターを用いて30 °Cで6,000 ×gにて約5分間遠心し、サンプルを500 µL未満まで濃縮します。ろ液を廃棄した後、残りのサンプルをフィルターに加えます。

RNaseフリーの1X TEバッファーを用いて、液量を4〜5 mLまで増やします。その後、目的の濃縮量が得られるまで再度遠心分離を行います。遠心後約5分経ってから、フィルターに4〜5 mLのRNaseフリーの1X TEバッファーを加え、濃縮させます。

同様に、この洗浄をさらに5回繰り返し、核酸サンプルを完全に脱塩します。サンプルの濃縮と脱塩が完了したら、残った核酸サンプルを滅菌済みの1.7 milliliterマイクロ遠心チューブに移します。溶液量の1/10量の酢酸ナトリウム、2倍量の100% ethanol、および1 microliterのglyco blueを加え、ボルテックスミキサーで十分に混合した後、遠心分離して核酸を沈殿させます。

4°Cで28,000 ×g、60分間遠心分離します。ペレットを乱さないように注意してください。

70%エタノールを300 µL加え、室温、28,000 ×gで10分間遠心分離し、乾燥させた後、各フラクションを適切な量のRNaseフリーTEバッファーに再懸濁します。等濃度のウイルス核酸であるM13 MP18（一本鎖DNA）、MS2（一本鎖RNA）、Φ6（二本鎖RNA）、およびλ（二本鎖DNA）を混合し、本ビデオに示すようにヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて分離しました。レーン6に示すように、等濃度のM13 MP18（一本鎖DNA）、MS2（一本鎖RNA）、Φ6（二本鎖RNA）、およびλ（二本鎖DNA）を混合し、ここに示すようにヒドロキシアパタイトカラムに供しました。

一本鎖DNA、RNA、および二本鎖DNAを、0.12 molar、0.18 molar、0.40 molar、および1.00 molarのリン酸緩衝液を用いてヒドロキシアパタイトカラムから個別に溶出させた。ゲノムサイズを確認するために1 KBラダーを使用した。これらの結果は、本手法を用いることで、分画間のキャリーオーバーを9%未満に抑えつつ、一本鎖DNA、二本鎖DNA、およびRNAを良好に分離できることを示している。

この手法は、ここに示すように、チェサピーク湾内のウイルスコミュニティから単離された核酸の分離にも用いられました。一本鎖DNA/RNAおよび二本鎖DNAは、それぞれ0.12 molar、0.20 molar、0.40 molar、または1.00 molarのリン酸緩衝液濃度を用いて独立して溶出されました。レーン1には高分子量DNAラダーを、レーン2には1 KBラダーを用いて、核酸のおおよその分子量と質量を視覚的に確認しました。ここで見られるように、チェサピーク湾のウイルスプランクトンから抽出された核酸の中で、二本鎖DNAが主要なタイプでした。このビデオを視聴することで、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて混合ウイルス群から核酸を分離する方法について十分に理解できるはずです。

これには、ヒドロキシアパタイトカラムおよび核酸の調製、さまざまな濃度のリン酸緩衝液を用いた核酸の分離と溶出および脱塩、そして分離後の核酸の濃縮が含まれます。