イントラ小胞体のCaの光学マッピング ²⁺とランゲンドルフ灌流ウサギの心臓における膜電位

この手順の全体的な目標は、無傷で分離された LOR 灌流ウサギの心臓における遊離筋小胞体、カルシウム、および膜貫通電位を同時に光学的にマッピングすることです。これは、最初にウサギの心臓を切除し、逆行性乳頭蓋灌流のために大動脈をカニューレすることで達成されます。2番目のステップは、Perfu Eightに励起収縮の分離を追加することで収縮を排除することです。

次に、灌流を小容量の再循環ループに切り替え、室温で低親和性カルシウムインジケーターを添加します。最後のステップは、大容量の増殖ループを使用して心臓を摂氏37度まで温め、電圧感受性色素を追加することです。このように、実験中は、心臓を青色光で励起し、高速CM OSカメラで放出された光を測定することで、カルシウムと膜貫通電位の変化を測定します。

この手法が既存の方法と比較した場合の主な利点は、研究者が膜貫通型カルシウムシグナルからの干渉なしに、筋小胞体または SR の短いカルシウム動態を直接プローブできることです。この方法はまた、膜貫通電位がSRカルシウムと同時に記録されるため、不整脈に寄与するSRカルシウムの取り扱いの役割に関連する重要な質問に答えるのを助けることができます、一般的に、この方法に不慣れな個人は、光学SRカルシウム信号が非常に低い振幅であるため、苦労します。したがって、カルシウムインジケーターの適切な負荷が不可欠です このプロトコルでは、作りたてのチロ溶液を手元に用意する必要があります。

4リットルで十分です。濃縮されたストック溶液を希釈せずに混合しないでください。また、テキストプロトコルの指示どおりに、他の溶液を事前に準備して、95%の酸素と5%の二酸化炭素をチロスの供給に泡立て、ガスの流れを調整して溶液のpHを7.4に非常に近く設定します。

溶液は室温で行う必要があります。パフューセートをろ過するために11ミクロンの細孔を持つインラインナイロンフィルターを配置して、再循環Lアンドルフ灌流システムを準備します。次に、約2リットルの酸素化チロでメインの増殖システムをプライミングします。

2リットルの総容量には、リザーバー内の溶液が含まれています。次に、溶液リザーバーをバイパスする短いプロフュージョンラインを準備してプライミングし、インフルエンザoh five N amの小容量の再循環プロフュージョンループを作成します。小型の再循環システムの総量をダウンロードすると、約150ミリリットルになります。

圧力監視システムを準備するには、圧力トランスデューサをプロフュージョンラインに接続し、トランスデューサの出力をトランスブリッジアンプに接続します。次に、データ収集システムをオンにします。ECGと滲出圧力を継続的に監視するように設定します。

次に、ベースライン灌流圧力を水銀柱の0ミリメートルに調整します。最後に、テキストプロトコルで説明されているように、光学マッピングカメラの位置を合わせます。まず、ウサギを固定し、ペントバルビタールと1000単位のヘパリンボーラスで麻酔します。

うさぎを落ち着かせるために目を覆います。鈍い先端のはさみを使用して胸骨と肋骨を露出させるために、正中線を切開することから始めます。剣状突起とマイバムの間の胸骨を切ります。

次に、心臓を傷つけないように慎重に胸骨を開き、肋骨を広げて心臓を露出させます。次に、周囲の血管と組織をすべて切り取って、心臓肺ブロック全体をすばやく取り除きます。心肺ブロックを約100ミリリットルの氷冷チロ溶液に移します。

切除された組織ブロックで、大動脈を特定し、大動脈弓の 3 つの枝のすぐ近位にある上行大動脈を切断します。次に、8ゲージのカニューレをプロフュージョンシステムに取り付けられた状態で大動脈をカニューレします。USP Zero Silk Seamture で大動脈をカニューレに固定します。

カニューレを固定した後、気管、肺、心外膜脂肪を慎重に解剖します。次に、僧帽弁を特定し、鋭利な鉗子とはさみを慎重に使用して、1つの弁尖を損傷または除去します。したがって、左心室での溶液のうっ血は起こり得ません。

続いて、心臓を灌流室に水平に沈め、前面を上にして行います。カニューレをサードの上に置きます。カニューレを、Sardのピースを通して挿入し、灌流皿のシリコン底に挿入したU字型のピンで固定します。

これにより、心臓が動くのを防ぐことができます。イメージング中は、必要に応じて小さな昆虫ピンを使用して頂点を安定させ、カニューレ挿入中に使用されるチロ溶液の量を測定し、それを新しい溶液と交換して、総循環溶液を2リットルに保つことができます。次に、ECG電極を心臓の両側の浴槽に完全に浸しますが、心臓と接触しないようにします。

次に、これが正常なリード1のECG形態になることを確認します。その間、灌流の流れを毎分25〜35ミリリットルに調整することにより、大動脈圧を水銀柱の60〜70ミリメートルに維持します。次に、部屋の照明を消し、0.3〜0.6ミリリットルのBLEsスタチンストック溶液をPERFU 8に加えて、最終濃度を10〜20マイクロモルにします。

10〜15分後、心臓の収縮は止まるはずです。その後、小容量増殖システムに切り替えます。SRカルシウムイメージングを成功させるための鍵の1つは、フロー5 N am色素の適切なローディングです。

これには、高い色素濃度と室温条件を達成するために、少量の灌流が必要です。サイトゾル中のDのDエステル化を避けるために、500マイクロリットルのインフルエンザO 5 N amローディング溶液を準備し、500マイクロリットルのロード溶液と混合します。次に、それをPERFU 8に追加します。

ダウンロードを45分間進めてから、循環水浴をオンにしてシステムを摂氏37度に温めます。ダウンロードから1時間後、大音量のPerfu eightに戻します。次に、50マイクロリットルの電圧感受性染料RH 2 37を1ミリリットルの温かいチロに混ぜます。

これを約5分かけてゆっくりとシステムに注入し、心臓の光学マッピングを進めます。まず、光学マッピングカメラを適切なフィールドに焦点を合わせて、PERFU 8表面の動きを減らします。溶液にカバースリップを浮かせます。

次に、LEDの光線を調整して、心臓を均一に照らします。光記録ごとに、目的のペーシングプロトコルを設定します。励起ライトを点灯し、1〜2時間以内に1〜4秒のデータを収集します。

漏れた染料からのノイズは実験を終わらせます。次に、システムを脱イオン水で洗い流します。次に70%エタノールを添加し、脱イオン水をもう一度すすいで仕上げます。

記載されたプロトコルを使用して、膜貫通電位シグナルと筋小胞体またはSRカルシウムシグナルのスペクトル分離を分離することができる。連続ペーシング中の光学トレースも記録されました。次に、各ピクセルの活性化時間をプロットすることにより、データから活性化マップを構築しました。

等時グラフでは、2 つの信号間には通常 8 ミリ秒から 10 ミリ秒の遅延があります。拡張期SRの相対的な変化を定量化することが可能であった。カルシウム負荷と収縮期SRカルシウムは、さまざまなペーシングサイクルで振幅を放出します。病理学的SRカルシウムの取り扱いは、ベータアドレナリン受容体アゴニストイソプロテレノールの適用後に観察されました。.

赤い矢印は、srからの明確なカルシウム漏れを示しています。これらの条件下では、カルシウム媒介性活動電位のトリガーが発生する可能性があります。このビデオを見れば、無傷のLang Endorf灌流ウサギの心臓における膜貫通電位とSRカルシウムシグナルの光学マッピングを同時に行う方法について理解できるはずです。