エンドソーム溶解試薬dfTATとのインキュベーションによって生細胞へのタンパク質、ペプチドまたは細胞不浸透性小分子の送達

次の実験の全体的な目標は、細胞に損傷を与えることなく非常に効率的に細胞に浸透できる試薬である二量体、蛍光tat、またはdf tatを使用して高分子を生細胞に送達することです。これは、最初に送達剤を生成して精製することによって達成されます。第2のステップとしてのDfta。

Dftaは、目的の高分子カーゴの存在下で37°Cで1時間細胞とインキュベートされ、df tatはエンドサイトーシス小胞内のカーゴの取り込みを誘導します。小胞は初期のエンドソームに成熟し、最終的にDFタットが細胞の細胞質空間にカーゴを放出できる後期エンドソーム段階に達します。次に、デッタと目的のカーゴの送達効率を評価するために、細胞を蛍光顕微鏡で画像化します。

結果は、DF TTが高効率で細胞に侵入でき、観察可能な細胞毒性がないことを示しています DF tat は、蛍光顕微鏡で観察できるように、さまざまなサイズの高分子を細胞の細胞質空間に送達できます。この手法が既存の固体送達アプローチと比較した場合の主な利点は、当社の送達剤が高い送達効率を持ち、細胞生理学に観察可能な悪影響がないことです。さらに、簡単なcoインキュベーションステップのみを必要とするため、使いやすいです。

まず、FTA合成は、標準的な50ミリリットルのSPPS容器に500ミリグラムのRアミド、MBHA樹脂、ジメチルホルムアミドまたはDMFを膨潤させ、反応を泡立てるのに十分な窒素ガスを使用して室温で反応を行います。各アミノ酸カップリング反応のテキストプロトコールに記載されている各FM保護アミノ酸の1.2ミリモルを使用して、リンクアミドMBHA樹脂上にFTAを合成します。また、DMFに溶解したHBTUのポイント44グラムとDIEAのポイント51ミリリットルを追加すると、4時間のカップリングに続いて4時間、各アミノ酸カップリング反応が実行されます。

レジンをDMFで洗浄し、テキストプロトコルに記載されているFD保護手順を実行します。FTAの直鎖ペプチドが合成されるまで繰り返します。次に、1%tri Fluor 酢酸またはTFAと2%tri Isopropyl cyまたはTISからなるDCM溶液20ミリリットルとレジンをインキュベートし、MTT保護基をクリーブします。

MTT保護グループを削除すると、黄色に見えるため。DCMとDMFを挟んでレジンを洗浄しても黄色が観察されなくなるまで、これを繰り返します。DCMに1%TFAを含む溶液をレジンに追加して、MTTが除去されず、溶液が透明なままになるようにします。

次に、T-M-R-H-B-T-UとDIEAをDMFに溶解し、この混合物を樹脂に加えます。乾燥窒素を使用して一晩中反応を行い、fm d保護とアミノ酸結合後の攪拌を行います。レジンをDCMで洗浄し、乾燥させてレジンからペプチドを完全に切断します。

92.5%TFA、2.5%水、2.5%TIS、2.5%エタンジチオールを含む溶液をペプチジル樹脂に室温で3時間添加し、樹脂からの全球的な深い保護と切断を実現します。調製した溶液を40ミリリットルのエイルエーテルに排出することにより、冷たい無水エチルエーテルを使用して粗ペプチド生成物を沈殿させます。これを摂氏4度と4、000Gで20〜25分間回転させます。

このステップを繰り返して、冷たい無水エチルエーテルreusで沈殿物を洗浄できるようにします。沈殿物を水中に懸濁し、凍結乾燥した後、0.1%水性TFAアセドナイト試験で得られた生成物を再懸濁します。分析用C 18カラムを使用して、高速液体クロマトグラフィーまたはHPLC分析を実施します。

各ペプチドの分析には、1分あたり1ミリリットルの流速を使用し、214ナノメートルと550ナノメートルで検出します。次に、ペプチド精製のためにC 18カラムでセミ分取HPLCを実行します。毎分4ミリリットルの流量を使用し、すべての実行で214ナノメートルと550ナノメートルで検出します。

酸化反応を行う前に、線形勾配を使用してください。MALDIによるペプチドの正しい同一性を、製造元のプロトコールに従って確認します。FTAを曝気されたリン酸緩衝生理食塩水に溶解します。

pHが7.0〜7.5であることを確認してください。ペプチドを添加した後、反応を一晩で変異させて、反応が完了するまで反応させます。逆相HPLCを用いて製品を精製し、前回と同様に質量分析法で分析し、純粋なDFタットを凍結乾燥し、200マイクロリットルの水に懸濁して濃度を測定します。

まず、Resusは、精製したDFタットのアリコートを149マイクロリットルの50ミリモルTCEP溶液に懸濁し、サンプルを約20分間反応させます。このステップでは、DFタットをモノマー対応物Fタットに低減し、TMRフロア4とDFタットが近接していることによる吸光度消光を排除します。すべての溶液をクォーツCVEに追加し、556ナノメートルでの吸光度を測定します。

ビールの法則を使う。溶液の濃度を決定します。これはftaの濃度に対応します。

FTAの濃度を2で割って、dftaの濃度を求めます。5%CO2を含む摂氏37度の加湿雰囲気で80〜90%の密度になるまで適切な培地で細胞を増殖させ、細胞を200マイクロリットルのPBSで3回、NRL 15で1回洗浄します。5マイクロモルdf tat(強化された緑色蛍光タンパク質など)の有無にかかわらず、細胞をインキュベートし、インキュベーション後にエンドソーム漏出を誘発するために摂氏37度で1時間保持します。

L 15培地中のヘパリンで細胞を3回洗浄し、細胞の原形質膜に結合したDFタットを除去します。最終ステップの画像として、蛍光顕微鏡を用いた細胞は、赤色蛍光タンパク質またはRFPフィルターを用いてDF tatを画像化し、F TATとD fttの違いを評価します。ヒーラ細胞を各ペプチドとインキュベートして、細胞の局在の違いを決定します。

ここに示すように、FTA は点状分布にローカライズされます。この分布は、ペプチドがエンドソーム内に閉じ込められたままであることと一致しています。対照的に、dftaの蛍光シグナルは、細胞質と核全体に均一に分布しています。

DF tatの細胞質分布は、多くの異なる細胞株で観察されます。20 x 画像は、ディッシュ内の非常に高い割合が、細胞毒性のない DF tat の細胞質ゾル分布を示していることを示しています。これは、dfta 媒介性エンドソーム漏出が細胞のサイトゾルに大きなタンパク質を送達するかどうかを決定するための cyt blue 核染色が見られません。EGFPは、正しく折りたたまれたタンパク質の送達を検出するために使用されました。

EGFPは、観察可能な毒性のない細胞の90%以上でDF tatで観察されたものと同様の細胞質および核緑色蛍光分布を示しました この手順を試みる際には、細胞が過度にコンフルエントであってはならないことを覚えておくことが重要です。さらに、dfタップを追加する前に、細胞を十分に洗浄してFPSを除去する必要があります。