堅牢、マイクロ流体細胞内送達プラットフォームとしての細胞絞る

落下実験の全体的な目標は、機械的破壊を使用して、高分子を標的細胞にベクターフリーで送達することです。これは、まず標的細胞タイプを目的の送達材料と共に懸濁液に入れ、特別に設計されたマイクロ流体デバイスのリザーバーにロードすることによって達成されます。第2のステップとして、マイクロ流体デバイスを加圧し、細胞を圧迫する一連のマイクロ流体チャネルを介して細胞を駆動して、一過性の膜破壊を促進します。

次に、細胞を標的送達材料の存在下でインキュベートさせて、細胞細胞質への物質の拡散輸送を促進します。細胞膜が修復されている間。フローサイトメトリーの使用による高分子の効果的な送達を示す結果が得られます。

この手法は、イオンやリポの完全性などの既存の方法と比較した場合の主な利点は、他の方法では効果的に送達できない困難な細胞タイプや材料に対処できることです。この方法は、細胞の再プログラミングをどのように改善するかなど、生物学分野の重要な質問に答えることができます。この技術の意味は、システムが免疫細胞を操作して抗腫瘍効果を高めることを可能にするため、がんの治療と診断にまで及びます。

まず、ここに示されているマイクロ流体デバイス、デバイスホルダー、プラスチック流体リザーバー、およびOリングを製造または購入し、付属のテキストプロトコルに詳細が記載されており、3つの密封可能な容器を途中まで70%エタノールで満たします。デバイスを最初のコンテナに、リザーバーとOリングを2番目のコンテナに、ホルダーを3番目のコンテナに置きます。次に、残りの部分でコンテナを70%エタノールで満たします。

次に、リザーバーとOリングが入った容器、およびホルダーが入った容器を超音波浴で5〜10分間使用します。これにより、以前の実験から汚染粒子を除去するのに役立ちますが、成分の超音波処理は70%エタノールでバイオセーフティキャビネット内のワークスペースを拭き取ります。次に、3つの容器とピンセットのペアを含むすべての必要な材料を70%エタノールで拭き取って滅菌し、バイオセーフティキャビネット内に置いて組み立てを開始します。

まず、作業エリアに2〜3枚の低糸くずのワイプを置きます。次に、ピンセットでエタノール容器からプラスチックリザーバーを取り出し、ワイプにセットして、内面からのエタノールの吸湿と蒸発を促進します。リザーバーを軽くたたいて、エタノール溶液の除去を助けます。

必要に応じて、加圧ガスを使用してリザーバーを完全にパージします。リザーバーが乾いたら、Oリングをリザーバーの適切なスロットに挿入します。次に、ピンセットを使用して、チップを上向きにしてデバイスホルダーに置きます。

チップがホルダーに平らに横たわっていることを確認し、必要に応じてピンセットを使用して調整します。デバイスがホルダーに適切に収まらないと、後続の手順でデバイスが破損するリスクがあります。次に、リザーバーをホルダーにそっと置き、クリップに合わせます。

Oリングがスロットから落ちないように注意してください。このプロセスでは、リザーバーが所定の位置にカチッと収まるまで、リザーバーをそっと押し下げます。リザーバーの両側が固定されていること、およびチップが正しい位置にあるように見えることを確認します。

リザーバーを無理な力で押し下げないでください。圧力が一次または付着のためにチップを壊す可能性があるためです。細胞株は、実験の1〜2日前に細胞を80%以下のコンフルエントになるように配置します。

実験当日。実験の直前に、細胞を回収して蘇生し、1ミリリットルあたり1〜1000万個の細胞で培地または他の所望の緩衝液に懸濁します。次に、細胞懸濁液を40ミクロンのセルストレーナメッシュに慎重に通過させ、細胞の塊やマトリックスがデバイスを詰まらせるのを防ぎます。

濾過したら、300マイクロリットルの細胞懸濁液を別のチューブ内で所望の濃度の送達材料と混合した。このデモンストレーションでは、5ミリグラム/ミリリットルのデキストリン2マイクロリットルとAlexaの2マイクロリットル。細胞懸濁液50μリットルあたり4 88アイソトープコントロール抗体を添加する。

次に、ピペッティングにより100マイクロリットルの細胞を穏やかに混合します。次に、ゲルローディングチップを使用して、細胞と送達材料をいずれかのリザーバーにピペットで固定し、充填されたリザーバーに圧力チューブを取り付け、結び目を指で締めて適切な天井を確保します。次に、レギュレーターの空気圧を70 PSIに調整して、セルがデバイスを通過する速度を制御します。

圧力は、各実験で使用される特定の細胞とマイクロ流体チップの組み合わせに最適化する必要があります。すべての準備が整ったら、デバイスを目の高さまで上げ、リザーバー内の液体が見やすいように向きを変えます。次に、プッシュボタンバルブを押してリザーバーを加圧し、セルの流れを開始します。

液体がリザーバーから流れている速度を監視します。流体が初期流量に比べて大幅に遅くなる場合は、取り付けられたデバイスが詰まっている可能性が高く、交換する必要があります。閉塞によって引き起こされるせん断の増加は、通常の細胞死よりも大きくなります。

液面がリザーバーの底から約2ミリメートルになったら、レギュレーターをすばやくゼロPSIに回して流れを停止します。リザーバーが空になる前に空気の流れを止めることが重要です。そうしないと、サンプルが収集リザーバーから排出される可能性があります。次に、処理した細胞を流出リザーバーから収集し、マイクロ遠心チューブに入れます。

室温では、定格細胞は最大10分間材料を取り込み続けます。10分後、細胞に追加の培地をプレートするか、実験のニーズに応じて細胞の使用を続けます。これらの手順を繰り返して、必要な数の処理済み細胞を採取し、後続のサンプルごとにC詰まりしたデバイスを詰まらせて廃棄した場合は、必要に応じてチップを交換します。

目詰まりの影響を最小限に抑えるために、流れの方向を変えてください。細胞の収集が終了したら、クリップアームを脇に押して、リザーバーをメインホルダーからそっと外します。次に、再利用する各部品を適切な保存容器に入れ、新鮮な70%エタノールで満たします。

最後に、使用済みのチップをすべて別の容器に入れて、適切に廃棄します。ヘラ細胞の送達効率と細胞生存率を測定しました。一連の実験の後、3つの異なるマイクロ流体チップが毎秒600ミリメートルまでの速度でテストされました。

これらの試験では、流速の増加により、試験した各チップの細胞内への蛍光標識3キロダルトンデキストリンの送達が改善されることが示されました。さらに、速度の向上により、試験したデバイスでは細胞生存率が約20%低下しました。この細胞死の量は比較的低く、不適切に設計されたデバイスでははるかに高くなることがよくあります。

左に示すコントロール細胞集団へのパシフィックブルーコンジュゲートデキストリンの取り込みは、限られた表面結合とエンドサイトーシス効果の結果です。細胞は、処理された細胞と同じ時間、送達材料に曝露される。右側は、対照細胞と同じ濃度のデキストリンに曝露された状態でマイクロ流体デバイスを通過する生細胞の集団です。

網掛けされた領域のセルは配信されていないと見なされ、行の右側にあるセルは配信済みと定義されます。このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば1時間以内に完了することができます。この手順に続いて、他の方法、寿命ポスト検眼は、その開発後、送達効率や材料機能などの追加の質問に答えるために行うことができます。

この技術は、再生医療の分野の研究者が、直接タンパク質送達を使用して成体初代細胞の細胞プログラミングを探求する道を開きました。このビデオを見た後、目的のアプリケーションに合わせてセルフスクイーズシステムをセットアップして操作する方法をよく理解しているはずです。