血管細胞リモデリングの研究への応用生理学的および病理学的血流のインビトロモデル

次の実験の全体的な目標は、さまざまな拍動流の病状が内皮細胞に及ぼす影響を観察することです。インビトロ。これは、最初にスライドガラスを化学的に処理し、タンパク質でコーティングして、流れにさらされる際の細胞の付着を確保することによって達成されます。

第2のステップとして、流れの拍動性指数が決定され、これにより、in vitroの流れと文献に記載されている値との比較が可能になります。次に、細胞に装着されたスライドをフローシステムに接続して、フローの病理に対する細胞の応答を測定します。その結果、光学顕微鏡法と免疫蛍光染色法を用いたフロープロファイルに基づく形態とタンパク質発現の変化が示されました。

蠕動ポンプまたは拍動ポンプに対するこの手法の主な利点は、疾患または健康な反応を模倣するために流量の脈動性を調整できることです。これは、動脈疾患の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。まず、75mm×50mm×1mmの新しいスライドガラスをきれいなスライドガラス染色皿に入れます。

次に、スライドガラスを完全に浸すのに十分な20%硫酸溶液を加え、翌日一晩酸性溶液にインキュベートします。スライドを毎回5分間新鮮な脱イオン水に浸して、スライドを3回洗います。すすぎたら、スライドをアセトンに30分間浸し、次にアセトン中の6%3アミノプロピルトリキシセリンの溶液に一晩

次に、スライドを純粋なアセトンで5分間3回すすぎ、洗浄のたびにアセトンを交換します。次に、スライドを脱イオン水で5分間3回洗浄し、洗浄するたびに脱イオン水を交換します。次に、スライドを1.5%グルタルアルデヒドに浸し、60分間沈めます。

架橋されたら、スライドを脱イオン水で2回洗浄し、各洗浄後に脱イオン水を交換し、スライドを70%エタノールに30分間入れて滅菌します。エタノールを取り除き、残っている残留物をスライドから蒸発させます。乾いたら、スライドを滅菌脱イオン水に短時間置いて水分を補給します。

次に、スライドホルダーを取り外し、100mm×100mm四方のシャーレに入れます。層流フードでは、官能基化スライドを1ミリリットルあたり25マイクログラムのフィブロネクチン溶液でコーティングし、細胞培養チャンバーに曝露されるおおよその領域をカバーします。次に、皿を覆い、スライドを摂氏37度で1〜2時間インキュベートしますインキュベーション後、残りの溶液を吸引し、スライドのコーティング面に10%FBSのDMEMの1ミリリットルに600,000個の内皮細胞を播種します。

チャンバーを覆い、細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で120分間インキュベートします。次に、細胞を追加の培地で覆い、70〜80%のコンフルエントになるまでインキュベートを続けます。付属のテキストプロトコルで説明されているようにフロー回路を接続し、ここに示すように、ダンピングチャンバーと超音波流量計が正しい流れ方向に配置されていることを確認します。

次に、フロー、回路、リザーバーを脱イオン水で満たします。リザーバーアウトレットチューブがリザーバーボリューム内に沈んでいることを確認します。次に、流量計を使用して流れの波形を視覚化します。

ダンピングチャンバーのエアリリースバルブを開いて、流体と空気の体積比を変更します。異なる液面間隔でエアリリースバルブを閉じ、脈動指数を計算します。インデックスを計算するには、ピークがVMの最大値を表すため、フロー波形を評価します。

トラフは v min を表し、V 平均は信号レコードの平均です。ノートブックの puls インデックス値。結果として生じる液面と脈動度指数を、フェルト先端の永久インクペンを使用してダンピングチャンバーにマークします。

付属のテキストプロトコルで参照されている病理学文献から、フローチャンバーのウォームアップを準備しながら、目的の脈動指数レベルを決定します。DMEMは、摂氏37度の水浴中で1%FBSを添加しました。セルコーティングされたスライドの1つをメディアから取り出し、70〜80%のコンフルエントになったら、セルの着座側の上にガスケットを置きます。

次に、フローチャンバーの真空チャネルをガスケットの穴に合わせます。次に、真空チューブを真空ポートに取り付けて、媒体が真空に漏れないようにします。スライドガラスの下にポリカーボネートシートを置き、フローチャンバーアセンブリを短辺のそれぞれに1つのスプリングクランプで固定し、フローチャンバーの長辺に沿って2つのスプリングクランプで固定します。

次に、フローチャンバー、インレット、アウトレットをフロー回路に接続します。フローシステムを摂氏37度、二酸化炭素5%に設定されたインキュベーターに置き、リザーバーに培地を充填し、低脈動度でポンプインすることにより、回路に予熱培地を充填します。このフローを4時間維持して、細胞を前処理します。

次に、ダンピングチャンバー内の流体量を事前にマークされた脈動指数レベルと培養に調整します。目的の期間のセル。ここに示されている内皮細胞は、無流、定常流、および拍動流で培養されました。

形態の変化は、高拍動流への24時間の曝露後に、典型的な内皮細胞の形態からより紡錘体のような形態に見られることがあります。静的流れと定常流れはどちらも、形態にほとんどまたはまったく違いを示していません。平滑筋細胞は、高脈動流にさらされた内皮細胞との共培養によっても影響を受けます。これは、アルファ平滑筋アクチンとミオシン重鎖の異なるレベルによって示されています。

さまざまな流動条件を通じて、拍動流にさらされた細胞は、肥大と収縮性を示す両方のタンパク質を最も多く示しました。この手順を試行する際は、すべてのシールを維持し、この手順に従って液体レベルが一定に保たれるようにすることを忘れないでください。他の方法、例えば、内皮細胞、血管細胞共培養は、細胞間相互作用などの追加の質問に答えるために実施されてもよい。

このビデオを見れば、フロー回路の組み立て方、インデックスの制御方法、内皮細胞を拍動フローにさらす方法についてよく理解できるはずです。