タンパク質 - 小分子標的薬のスクリーニングのための迅速かつ定量的蛍光法

この新しいフルオロメトリック薬物スクリーニング法の全体的な目標は、薬物を充填したタンパク質テンプレート内に蛍光金ナノクラスターを形成することにより、低分子薬物分子の標的タンパク質への結合親和性を決定することです。この方法は、薬物分子のビディング強度がアンフォールディングからタンパク質の安定性にどのように影響し、異なる強度の蛍光金ナノクラスターの形成につながるかなど、タンパク質ターゲティング薬の発見の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。このtenixの主な利点は、タンパク質ターゲットを蛍光バイオセンサーに変換して、高度な機器や面倒なラベリング手順を必要とせずに、低分子医薬品の迅速なスクリーニングを可能にすることです。

私自身の知識と共著者の組み合わせは、彼女が発見したタンパク質をロードし、プラズモニックに明確な安定化効果があります。ナノ粒子は、この方法のアイデアに影響を与えました。この手順は、ヒト血清アルブミンまたはHSAテンプレート金ナノクラスターを調製するためのテキストプロトコルに詳述されているように、薬物スクリーニング用の化学試薬の調製から開始し、それぞれがマイクロマグネティックスターバーを含む2つのガラスバイアルを2つの別々の温度制御可能なマグネティックスターク上に置きます。

1回のマグネチックスターの温度を摂氏60度に設定します。次に、200マイクロリットルのヒト血清アルブミン溶液、200マイクロリットルの超純水、200マイクロリットルの塩化金溶液を、タンパク質テンプレート内の金イオンのカプセル化を可能にするために、一定の攪拌下下で各バイアルに追加し、2分後に、各バイアルに20マイクロリットルの水酸化ナトリウム溶液を加えて、ヒト血清アルブミンの還元能力を活性化し、金ナノクラスターに情報を提供します。20 分ごとに 0 分で反応時間の記録を開始します。

各サンプルを50マイクロリットル引き出し、384ウェルの黒色プレートに移します。マイクロプレートリーダーで発光スペクトルを測定します。100分後にマグネティックスターを停止します。

ガラスバイアルを流水で流しのシンクで冷やします。各サンプルの光発光スペクトルを常にプロットして、さまざまな温度条件での金ナノクラスターの形成速度を取得します。ウシ血清アルブミンまたはBSAテンプレート金ナノクラスターを調製するには、マイクロマグネティックスターバーを含むガラスバイアルをマグネティックスターターの上部に置きます。

温度は室温のままにします。200マイクロリットルのBSA溶液、200マイクロリットルの尿素、200マイクロリットルの塩化金溶液をガラスバイアルに絶えず攪拌しながら混合します。2分後、20マイクロリットルの水酸化ナトリウム溶液で

BSAの還元能力を活性化して金ナノクラスターを形成し、反応時間をゼロ分として記録し始めること。反応混合物の光発光スペクトルを毎時測定します。それぞれにマグネチックスターバーが含まれ、薬物または純粋なHSAで事前に標識された5つのガラスバイアルを、温度制御可能なマルチポイントマグネティックスターの上に置きます。

各バイアルに200マイクロリットルのHSAを加えます。次に、以前に調製した各薬物溶液の1マイクロリットルを4つの対応するファイルに追加します。また、攪拌機の制御スイッチに1マイクロリットルのDMSOを追加します。

スピン速度を360RPMに設定し、1時間インキュベートして、1時間後に200マイクロリットルのミリQ水と200マイクロリットルの塩化金溶液で薬物をHSAに結合させ、絶えず攪拌しながら各バイアルに投与します。温度を摂氏60度に設定し、10分間絶えず攪拌します。各ファイルに1.5モルの水酸化ナトリウムの20マイクロリットルで10分後、ゼロ分で反応時間を記録し始めます。

測定のための共同反応溶液は、薬物を追加するのと同じ順序に従うべきであり、タイムラグ効果を最小限に抑えるためにできるだけ早く実践されるべきです 各バイアルから50マイクロリットルの溶液を迅速に引き出します。384ウェルの黒板に移し、発光スペクトルを測定します。各サンプルの発光スペクトルを10分ごとに記録し、4つの異なる時間に少なくとも4つのスペクトルを収集します。

これらの手順を数回繰り返して、一貫した傾向の結果を取得します。各サンプルの時間分解光発光スペクトルをプロットします。すべてのサンプルのピーク強度を特定し、時間に対してプロットして、さまざまな薬物負荷タンパク質テンプレートにおける金ナノクラスターの形成速度を比較し、各薬物とHSAとの間の結合定数を測定します。

薬液を4つの異なる濃度のイブプロフェン溶液に交換します。10分後、流しの流水でガラスバイアルを冷まします。各バイアルから上記の溶液50マイクロリットルを384ウェルの黒板に引き出し、発光スペクトルを測定します。

これらの手順をさらに2回繰り返して、磁気攪拌を停止する前に、異なる薬物濃度でさらに2セットの結果を取得します。次に、光発光スペクトルをプロットし、個々のバッチで得られた生の結果を分析します。Origin Proなどのソフトウェアで各サンプルの発光スペクトルをプロットし、ピーク強度を決定します。

薬物濃度に対する相対的な蛍光強度を計算してプロットします。次に、データを 1 つのサイト バインディング モデルに当てはめて、バインディング定数を計算します。Mics Cementin方程式を使用して、OriginProなどのソフトウェアでこれを行います。

メニュー解析フィット非線形曲線フィットを選択し、設定関数選択ページの成長シグモイドカテゴリから雹関数を選択します。[表示に合わせる]をクリックします。ここに示す適合結果は、異なるタンパク質変性条件で生成された金ナノクラスターの時間分解光発光スペクトルの代表的な結果です。

それは、より高い温度でより速く形成される金ナノクラスターで観察することができます。尿素変性条件は、BSAタンパク質をテンプレートとして使用して、金ナノクラスターの直接合成も促進できます。ここでは、薬物を充填したHSAをテンプレートとして使用した金ナノクラスターの蛍光強度に基づく高速蛍光測定薬物スクリーニングの典型的な結果を示します。

蛍光強度が高いほど、薬物分子のHSAへの結合強度は弱くなります。これらのスペクトルは、薬物負荷濃度がイブプロフェン負荷HSA内の蛍光金ナノクラスターの形成速度に及ぼす影響を示しています。薬物濃度が高いほど、ここに示される得られる金ナノクラスターの蛍光シグナルは、タンパク質薬物結合定数決定の代表的な結果です。

これは、MICUのセッチン式を用いて、様々な濃度のイブプロフェン薬物を予めロードしたHSAテンプレートで合成された金ナノクラスターの相対蛍光強度を適合させることによって計算される。このビデオを見た後、手綱を合成する方法、薬物を充填したタンパク質のナノクラスター化、および得られた金ナノクラスターから放出される蛍光シグナルによって検出可能な標的タンパク質への薬物の結合親和性を決定する方法について十分に理解できるはずです。