ソリッドステートナノ細孔を持つ監視タンパク質吸着

本手順の全体的な目的は、タンパク質吸着研究に使用するための人工膜にナノポアを作製することです。これは、ステムを用いて窒化膜にナノポアを穿孔することで達成されます。その後、ナノポアをチャンバーにロードし、イオン溶液で湿らせます。

これにより、液路がナノポアの両端を繋ぐブリッジを形成し、ナノポアが実験可能な状態になります。そこに電圧を印加すると、イオン電流が通過するのが観察されます。最終ステップは、ナノポアチャンバーにタンパク質を添加することです。

最終的に、ナノポアを流れるイオン電流に長時間のブロッキングが観察されることで、タンパク質がナノポアの側壁に吸着していることが明らかになります。こんにちは、デイブ・ウィッキーです。私はシラキュース大学物理学部の大学院生です。

この手法は、無機表面におけるタンパク質の吸着に関する知見を提供できるだけでなく、タンパク質と核酸の相互作用、単一分子分光法、および閉じ込められた空間における分子の研究など、他の系にも適用可能です。まず、ステムの加速電圧を上昇させることから始めてください。

次に、SPI社の窒化シリコンウィンドウグリッドをTEMサンプルホルダーに装着します。不純物を除去するため、酸素プラズマで30秒間グリッドを洗浄します。サンプルをロードする前に、サンプルホルダーをTEMに挿入し、真空ポンプで排気します。

明視野TEMモードを使用して、生プログラム上の明るい正方形であるナイトライドウィンドウを探します。TEMが適切にアライメントされていることを確認してください。その後、試料のアライメントとフォーカス調整を行います。

次に、システムをSTEMモードに切り替え、ホットオフ検出器を使用してサンプルの画像を撮影し、アライメントを確認します。モノクロメーターがある場合は、値を低く設定し、ドリリングに使用できる電子電流を高めます。電子プローブの径に基づいて、ナノポアをドリリングするのに適切なスポットサイズを選択してください。

ステムを調整します。BROGRAMを使用して、必要な倍率で窒化物膜に完全に焦点を合わせます。試料に動きがある場合は、電子ビームをブランクし、試料が安定するまで待ちます。

この工程には最大1時間かかる場合があります。安定後、電子プローブを試料上に配置し、ナノポアの穿孔を開始します。TMを用いてナノポアを穿孔するには、根気強い作業が求められます。

これは、電子ビームプローブの下で窒化物が徐々に消失していくプロセスです。電子プローブを穿孔部位の直上に維持し、ナノポアが完全に穿孔されたことを確認することが重要です。TEMからサンプルを取り出す前に、ホットオフ検出器でスキャンして定期的にサンプルを確認してください。

試料にわずかなドリフトが生じた場合は、電子プローブの位置を調整してナノポアの直上に合わせます。ROIグラムにピントが合うと、明滅する窒化物膜が消失します。ピントが外れた状態でナノポアが形成されると、縁のほつれたようなフリンジが見えます。

ヒーターをオフにした状態でナノポアを撮像し、画像の強度プロファイルを作成します。ナノポアの直径は、プロファイルの中で最も暗い領域によって推定できます。必要に応じて、電子プローブを用いてナノポアを拡大させることが可能です。

必要な直径に達したら、モノクロメーターを標準設定にした状態でTEMモードに切り替えます。明視野TEMを用いて、細孔サイズを確認してください。

まず、脱気した生理食塩水を準備します。溶液を真空下にし、バスソニケーターで20分間処理します。窒化シリコンチップを含む壊れやすいナノポアを、10 mLのPyrex製ビーカーに慎重に配置します。次に、ドラフト内でビーカーをホットプレートの上に置きます。

ピラーニャ溶液を用いて、Nanoporeチップを非常に注意深く洗浄します。まず、ガラスピペットを用いて、容器に3 mLの硫酸を加えます。次に、硫酸に1 mLの高濃度過酸化水素を注意深く加えます。

あらゆる予防策を講じてください。ナノポアチップを10分間浸漬させます。その後、ガラスピペットを用いて、ビーカーからピラニア溶液を取り出し、適切に廃棄してください。

次に、ビーカーに脱気した超純水を満たします。清潔なガラスピペットを使用して、ビーカー内の水を抜き、この洗浄操作を少なくとも5回繰り返します。清潔なピンセットでナノポアチップを取り出し、軽い吸引によって乾燥させます。

乾燥後、すぐにナノポアチップをチャンバーに封入します。チップはOリングまたはシリコンシーラントでチャンバーに固定してください。チャンバーに塩化カリウム溶液を満たします。

銀・塩化銀電極をチャンバーに接続します。電極は、銀線を一晩漂白剤に浸すことで作製できます。電極間に膜電位を印加し、パッチクランプアンプを用いて電流応答をモニタリングします。

ボルテージクランプモードにおいて、測定値から電流-電圧曲線を作成します。この曲線は高い線形性を示すはずです。1 M の塩化カリウムを使用する場合、ナノポアのコンダクタンスはその直径に対応します。

ナノポアが線形なIV曲線を示さない場合は、コンダクタンスが低すぎるか、ナノポアのオープンカレントが安定していません。これはナノポアが適切に密着していないことを示しており、piha洗浄を繰り返す必要があります。ナノポア内部に液体が存在していることを確認することが不可欠です。

このステップが適切に行われないと、ナノポアを通過するイオン電流に非常に大きなノイズが生じ、タンパク質のナノポアへの分配が著しく減少します。まず、目的タンパク質の精製サンプルをチャンバーの接地側バスに加えます。サンプルが十分に拡散するまで待ちます。

研究対象であるタンパク質の全電荷とは逆極性の膜電位バイアスを印加します。200 millivoltsの印加電位であれば、十分な観察が可能であるはずです。ほとんどのタンパク質分析物のイベントは、ベースラインからの過渡的な電流偏向として現れます。

信号が観察されない場合は、チャンバー内のタンパク質濃度を上げてください。電圧を高くすると、S/N比と明瞭度が向上します。ナノポアは数ボルトにまで耐えることができます。

タンパク質の吸着は、ナノポアのベースライン電流の長期的な変化として現れます。固体状態ナノポアにおける典型的な結果は以下の通りとなります。オープンポア電流は非常に安定している必要があります。

ナノポアのIV特性は高度な線形性を示すはずです。1 M KCl、10 M K₂HPO₄ pH 7.4において、IV曲線の線形近似の傾きからナノポアの単一コンダクタンスが求められます。コンダクタンスはナノポアの直径と直接的な関係があり、方程式と一致する必要があります。

この値は30%以内で一致する必要があります。値が小さすぎる場合、タンパク質の添加によって孔が塞がっていない可能性があります。タンパク質の吸着が持続的な電流の低下をもたらす場合、その後、急速なイベントが続くはずです。一部のタンパク質は非常に不安定であり、孔の内部で構造変化を起こします。

この場合、長期的な電圧降下に伴い、急速な変動が見られます。このビデオを視聴することで、走査透過電子顕微鏡を用いて固体ナノポアを作製し、それらを用いてSAタンパク質の吸着を測定する方法について十分に理解できるはずです。ピラニア溶液の取り扱いは非常に危険であるため、この手順を行う際は、常にドラフトチャンバー内で手袋、白衣、および化学用エプロンを着用するといった予防策を講じることを忘れないでください。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。