ヒトパラティーノ扁桃腺からBおよびTリンパ球の効率的な単離プロトコール

この手順の全体的な目標は、ヒト扁桃腺サンプルからBNTリンパ球画分を取得することです。この方法は、ウイルス性疾患の病因におけるBTリンパ球画分の役割は何かなど、ウイルス学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます それらの外科的除去から3時間以内。扁桃腺組織を、氷冷した無菌HBSS含有サプリメントで満たされた50ミリリットルの遠心分離チューブでラボに輸送します。

次に、ヒト組織の取り扱いに推奨される適切なバイオセーフティ手順を使用します。HBSSを含む新鮮なサプリメントで組織を湿らせ、扁桃腺を氷上の60ミリメートルのプラスチック製細胞培養プレートに移します。鉗子を使用して、目に見える血栓や脂肪組織、結合組織を取り除き、扁桃腺を5ミリリットルのHBSSを含む新しい60ミリメートルプレートにサプリメントとともに移します。

次に、カットします。扁桃腺組織は3〜10ミリメートルの断片に凝集し、続いて、プラスチック注射器のプランジャーエンドを使用して、10ミリリットルの新鮮なHBSSを含む新しい60ミリメートル細胞培養プレートで100マイクロメートルのプラスチック細胞ストレーナーに断片を移します。細胞ストレーナーを通して組織片を絞り、すべての組織が浸軟されたときに扁桃腺の破片がHBSSに完全に浸されたままであることを確認し、ストレーナーを廃棄し、得られた細胞懸濁液を氷上の50ミリリットルのプラスチック遠心分離チューブに移します。

新しいHBSS含有サプリメントを使用して細胞溶液を最終容量35ミリリットルにし、次に10ミリリットルの室温密度勾配溶液を数本の50ミリリットルのコニカルチューブに加えます。溶液を混合しないように注意しながら、密度勾配の上に細胞懸濁液を穏やかに重ね、遠心分離によって細胞を分離します。単核細胞は、チューブの底の沈殿物にある赤血球、線維芽細胞、および細胞破片との界面でふわふわの白い層に分離します。

10ミリリットルのピペットを使用して、単核細胞層を慎重に収集し、新しい50ミリリットルのチューブに単核細胞を引き込みます。次に、各洗浄ごとに25ミリリットルの氷冷PBSで細胞を3回洗浄し、最終ペレットを15ミリリットルのPBSに再懸濁します。生細胞の数を数えた後、細胞を氷上に置いて、磁気ビーズ分離によりトンサーT細胞を単離します。

単核細胞懸濁液をスピンダウンし、ペレットを7つの細胞に10倍あたり80マイクロリットルの氷冷分離バッファーに再懸濁します。次に、細胞懸濁液を滅菌2ミリリットルのチューブに移し、20マイクロリットルのCD3磁性抗体で摂氏4度で1時間インキュベートし、細胞と懸濁液をインキュベーションの終わりに保持するために連続的に穏やかに混合し、細胞を5ミリリットルの氷冷分離バッファーを含む15ミリリットルのチューブに移し、洗浄中にそれらを洗浄します。マグネットセパレーターをスタンドに取り付け、マグネットにコラムをセットします。

500 マイクロリットルの氷冷分離バッファーでカラムを洗浄し、カラムの上部に 40 マイクロメートルのストレーナーを置きます。次に、細胞ペレットを500マイクロリットルの新鮮な分離バッファーに再懸濁し、ストレーナーを介して細胞をカラムにロードし、EITを含むB細胞を15ミリリットルの円錐形に収集します。すべての細胞が収集チューブに入ったときの2つのボンアイス。

を10分の1あたり500マイクロリットルの分離バッファーでカラムを4回洗浄し、カラムリザーバーが空になるのを待ってから次の洗浄を適用します。最後の洗浄後、カラムを新しい15ミリリットルの収集チューブに移します。次に、カラムプランジャーを使用して、2ミリリットルの分離バッファーをカラムからチューブに押し込み、CDの3つの陽性T細胞画分を収集します。

単離されたBトンおよびtトン細胞画分を分析するには、CDの3つの陽性細胞画分とCDの3つの陰性細胞画分をペレット化し、2回目のスピン後に0.2%BSAまたはPBSAを添加したPBSの1ミリリットルで両方の細胞セットを洗浄します。100マイクロリットルの細胞とPBSAのアリコートをファックスラベリング用の適切な数のチューブに分配し、各チューブに適切な量のフルオロ4標識モノクローナル抗体またはコントロール抗体を添加します。次に、チューブを短時間ボルテックスし、インキュベーションの終わりに暗闇の中で摂氏4度で30分間インキュベートします。

チューブを新鮮なPBSAで2回洗浄し、1%パラフォームアルデヒドで細胞染色を固定して、PCRによって細胞内のアデノウイルスDNAの存在を検出します。適切なサイクリング条件下でPCR増幅を行い、得られたPCR増幅産物を1.5%AGROSゲル上で分離し、EDTAバッファーを興味津々にします。最後に、得られたバンドを適切な核酸染色で視覚化します。

標準的なプロトコルによれば、トンソ単核細胞の分離が成功すると、抗CD20および抗CDの2つの抗体を用いたフローサイトメトリー分析により確認されたBNTリンパ球の高度に精製された亜集団が得られ、それぞれbリンパ球およびtリンパ球集団が検出される。対照的に、単核細胞の非効率的な分離は、bリンパ球とtリンパ球の両方からの細胞の混合物である細胞画分をもたらす。サブポピュレーション、DNAおよびRNAは、先ほど実証したように、bリンパ球とtリンパ球を分離した磁気ビーズから抽出して、下流の分析を行うことができます。

例えば、ここでは、PCRによって検出されたTONSORのTリンパ球におけるアデノウイルスDNAの特異的検出は、質の高い細胞質を示しています。RNAは、単離されたトンサーB NTリンパ球からも抽出できます。一度モンスター2扁桃腺のサンプルは、技術が適切に実行されれば6時間以内に処理することができます。

この手順を試行する間は、扁桃腺サンプルをできるだけ早く処理することが重要です。洗浄ステップの数と洗浄バッファーの量も、良好な結果を得るための重要なパラメータです。この手順に続いて、QPCRやR-T-Q-P-C-Rなどの他の方法を実行して、ウイルスDNAとmRNAの発生後の定量的存在に関する追加の質問に答えることができます。

この技術は、ウイルス学分野の研究者がヒトリンパ組織におけるさまざまなウイルス種の病因と潜伏性を調査する道を開きました。このビデオを見た後、ヒト扁桃腺サンプルからBTリンパ球画分を分離する方法を十分に理解しているはずです。血液や組織など、人間由来のスクリーニングされていない材料を扱うことは、非常に危険であることを忘れないでください。

したがって、適切な安全対策に従う必要があります。