光駆動酵素的脱炭酸

この実験の全体的な目標は、可視光を使用して酵素反応を駆動することです。このアプローチでは、光を使用して、穏やかな反応条件下で脂肪酸を末端アルキンに変換します。脱炭酸にはCC結合の切断が必要です。

そして、この結合は非常に安定しているため、これは非常に難しい反応になります。光の利用は、このような難しい反応を実現するための持続可能なアプローチです。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、過酸化水素を反応に直接加えようとしたときに、酵素が不活性化

この技術の主な利点は、一定量の過酸化水素を供給することです。まず、精製されたOleTを光駆動型生体触媒に使用して、酵素の特性を評価しました。その後、産業用途の開発に重要な粗抽出物もテストしました。

合成OleT遺伝子を発現ベクターにクローニングし、テキストプロトコルに記載されているようにプラスミドをE.Coliに変換した後、3ミリリットルのLB培地を含む2つの試験管で細胞に100マイクログラム/ミリリットルのアンピシリンを接種します。プレカルチャーをシェーカーで15時間インキュベートします。2ミリリットルの培養物を2つの1リットルフラスコにアンピシリンを含む200ミリリットルのLBに希釈します。

フラスコを摂氏37度、180RPMのシェーカーでインキュベートし、培養物が0.6〜0.8の600ナノメートルの光学密度に達するまでインキュベートします。次に、0.5ミリモルのデルタアミノレブリン酸を培養物に加えます。次に、フラスコに0.2マイクログラム/ミリリットルのテトラサイクリンを添加することにより、細胞を誘導します。

培養物を摂氏20度、RPM180rpmで15時間インキュベートします。誘導後、培養物を遠心チューブにデカントし、チューブをGの12000倍、摂氏4度で20分間遠心分離します。上清を捨てます。

50ミリリットルの氷冷トリスバッファーをピペッティングしてペレットを再懸濁し、懸濁液を円錐形の遠心分離チューブに移します。Gの4000倍、摂氏4度で15分間遠心分離します。上清を捨て、ピペッティングを繰り返して各ペレットを3ミリリットルの緩衝液に再懸濁します。

30秒のサイクルを3回、サイクル間で1分間一時停止して超音波処理することにより、細胞を溶解します。次に、ライセートをGの15000倍、摂氏4度で20分間遠心分離し、無細胞抽出物を慎重に円錐形の遠心チューブにピペットで移します。光駆動型生体触媒用の粗抽出物を調製するには、1つの無細胞抽出物の3ミリリットルを10キロダルトンの遠心分離フィルターに移し、摂氏4度でGの4000倍で遠心分離して小分子を除去します。

タンパク質を3ミリリットルのトリスに再懸濁します。光駆動型生体触媒におけるOleTの活性を特徴付けるには、タンパク質を精製する必要があります。タンパク質の精製を開始するには、3ミリリットルの無細胞抽出物を平衡化したニッケルNTAスピンカラムにロードします。

カラムを下部プラグとスクリューキャップで密封します。そして、樹脂が均一に分布するまで軽く振ってください。続いて、オーバーヘッドシェーカーでカラムをインキュベートします。

次に、カラムを遠心分離します。次に、1 mL の洗浄バッファーを添加し、700 倍 G で 2 分間遠心分離してカラムを洗浄します。さらに2回洗濯を繰り返します。

洗浄後、カラムを円錐形の遠心分離チューブに入れ、各カラムに1ミリリットルの溶出バッファーを加えます。チューブをGの700倍で2分間遠心分離し、溶出をさらに2回繰り返します。結合したカラム抽出物を10キロダルトンの遠心分離フィルターに加え、Gの4000倍、摂氏4度で遠心分離して、溶出に使用したイミダゾールを酵素から分離します。

最後に、テキストプロトコルに示されているように、タンパク質の純度と濃度を決定します。バイオトランスフォーメーション手順を開始するには、まず蒸留水にテルジトールなどの界面活性剤を10%と28.4ミリグラムのステアリン酸を加えて、10ミリリットルの10ミリリットルのストック溶液を作ります。ステアリン酸が完全に溶解するまで、加熱チャンバー内で溶液を摂氏60度で加熱します。

この溶液を使用して、次のプロトコルに従って反応混合物を調製します。FMN、EDTA、バッファー、ステアリン酸を2本の透明ガラス管に加え、25°Cの水浴で攪拌します。精製した酵素または粗抽出物のミリリットルあたり200マイクログラムをチューブに加えることによって続けて。

そして、2センチの距離で透明なLED電球でそれらを照らします。次に、200マイクロリットルの37%塩酸をあらかじめ充填したチューブで特定の時点で200マイクロリットルのサンプルを採取し、反応を停止します。次に、10ミリモルのミリスチン酸溶液を5マイクロリットルを各サンプルに内部標準として追加します。

反応生成物を分析するには、500マイクロリットルの酢酸エチルをチューブに2回加えます。それらを混合し、13、000回G.Nextで1分間遠心分離するためにチューブを反転させ、マイクロ遠心分離管に上澄みの400マイクロリットルを移し、圧縮空気でチューブに穏やかに吹き込むことによってそれらを完全に蒸発させます。チューブに200マイクロリットルのMSTFAを追加します。

そして、混合物を摂氏60度で30分間インキュベートし、分析前にサンプルを誘導体化します。テキストプロトコルに記載されている温度プロファイルを使用して、水素炎イオン化検出器を取り付けたガスクロマトグラフに4マイクロリットルのサンプルを注入することにより、反応生成物を分析します。次に、各反応サンプルで形成される1つのヘプタデカンとベータヒドロキシ酸の比率を、質量分析計に結合したガスクロマトグラフで決定します。

テキストプロトコルで説明されているように、オーブンの温度と質量分析計の設定を使用します。各サンプルの1マイクロリットルをガスクロマトグラフに注入し、クロマトグラムを記録します。最後に、各サンプルのGCMSクロマトグラムをモニターし、メーカーのプロトコルに従って分析します。

酵素反応から得られた生成物の分子量は、質量分析計と組み合わせたガスクロマトグラフを用いて決定しました。アシル鎖が長い脂肪酸の場合、酵素OleTは、異なる長さのオレフィンへの脱カルボキシル化を優先的に触媒します。生体内変化反応からのサンプルは、水素炎イオン化検出器を取り付けたガスクロマトグラフによって分析されました。

ステアリン酸の脱カルボキシル化は、ステアリン酸の99%を1つのヘプタデカンと2-ヒドロキシステアリン酸の3.3:1の混合物に変換したヒドロキシル化反応よりも3倍速く起こることが示されました。一度習得すると、光駆動型の生体触媒は、私が適切に実行すると言えば、数時間で行うことができます。光触媒作用における課題は、有用な反応を光の収穫に結びつけることです。

私たちの場合、FMNという分子内の光を光増感剤として利用し、過酸化水素というトランスファー分子を介して酵素に結びつけています。