用いた機能クローニングアフリカツメガエル卵母細胞発現システム

この手順の全体的な目標は、有能な外胚葉で応答を誘導できる遺伝子産物の同定に適した、Xenopus 卵子、動物キャップシステムを実証することです。この方法は、誘導反応を引き出すためにどの遺伝子が必要かなど、発生生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、Xenopus卵子を発現系として使用して、標的組織に作用する誘導物質、または誘導物質の上流に作用する遺伝子を産生および同定することです。

この方法の視覚的なデモンストレーションは、解剖および組換えステップがステージに大きく依存し、洗練された技術を必要とするため、非常に有用です。麻酔をかけた雌のカエルから卵巣組織を採取した後、組織を約10〜20個の卵子を含む小さな断片に引き裂きます。そして、これらの断片を最初に新鮮なOR2溶液に移し、次にOR2含有2.0ミリグラム/ミリリットルのコラゲナーゼAに移します。

次に、フラグメントを新鮮なコラゲナーゼ溶液に移し、さらに1時間撹拌します。この治療の最後には、脱房した卵子が観察されることを期待してください。卵子を完全なOR2で10回洗浄し、次にOCMと略される卵子培養培地で2回洗浄します。

その後、卵子を新鮮なOCMに入れ、解剖顕微鏡で目視検査します。ステージ6の卵子は、小さくて未熟な卵子を捨てて分離します。次に、OCMを含むアガロースコーティングされたペトリ皿に卵子を入れ、注入するまで摂氏18〜20度に保ちます。

マイクロインジェクションの準備として、ガラスキャピラリーチューブをニードルプラーに入れて引っ張り、ガラスの先端をガラスから切り離して直径約20マイクロメートルの針を生成します。複合顕微鏡で、校正済みの眼マイクロメーターで針先を測定します。次に、35 x 10ミリメートルのペトリ皿の底の均一な層に粘土を押し込みます。

次に、モールプローブのようなツールを使用して、このレイヤーに平行な溝を作成します。粘土で裏打ちされた皿に、1x変性バルト生理食塩水(MBS)に約2ミリリットルの3%Ficollを入れます。次に、広口径ピペットを使用して卵母細胞をそれに移します。

卵子を果樹園に配置して、その後のマイクロインジェクション中に卵子が所定の位置に保持されるようにします。マイクロインジェクターを使用して、以前に生成されたmRNAのプールの約2マイクロリットルを針に充填し、バランスを調整してわずかな陽圧を生成すると、注入中に卵母細胞質が針に引き込まれるのを防ぎます。次に、赤道領域に各卵子に20ナノリットルのRNAを注入します。

その後、卵子をFicoll MBSに1時間放置し、その後、1x MBSに穏やかに移します。卵子を摂氏20度で8〜24時間インキュベートします。アニマルキャップアッセイを開始するには、ステージ11から11.5で、3/4x正常両生類培地(NAM溶液と略される)、細い鉗子、ヘアループ、以前に注入した卵子、およびゼノプス胚を収集します。

次に、ガラスカバーを約1mm×2mmの大きさに砕き、その端が磨かれて引き抜かれるまで炎にかけます。次に、前述のように、粘土を皿の中の単一の層に押し込みます。また、モールプローブを使用して、このコーティングに個々のカップ型の印象を作成します。

約2ミリリットルの3/4xNAMを皿に詰めます。そしてそれに、注入された卵子を移し、それぞれが単一のくぼみに固定されるようにいくつかを配置します。胚を準備するには、3/4x NAM溶液を含む皿に胚を移します。

外胚葉の年齢の病期分類コントロールとして使用する原腸のサブセットを選択し、それらを同じ溶液を含む別の皿に移します。そして、このプレートを脇に置きます。アニマルキャップアッセイで使用される胚の場合、2対の細い鉗子でビテリン膜を取り除きます。

その後、原腸を卵母細胞と一緒に粘土で裏打ちされた皿に移します。まず、赤道組織を避けるように注意しながら、2対の細かい前傘を使用して胚から動物のキャップを切り取ります。最初の方法を使用して組換え体を生成するには、内面がすでにくぼみに配置されている卵母細胞の動物半球に接触するように動物キャップを配置します。

そして、注入された卵子のいくつかについてこのプロセスを繰り返します。これらの組換え体が一緒に保持されるようにするには、湾曲したガラスカバースリップの破片をそれぞれの上に置き、動物が平らになりカバースリップが粘土に接触するまで下向きの圧力を加えます。2番目の方法を使用して組換え体を生成するには、動物のキャップと卵子を粘土の空の個々のくぼみに一緒に配置します。

また、アニマルキャップの内面が卵子に面していることを確認します。次に、粘土の小さな延長物を使用して2つの組織を一緒に固定します。いずれかの方法を使用して複数の組換え体が生成されると、培養とセットアサイドは胚を摂氏20度で制御します。

対照胚が所望の段階に達したら、組換え体からカバースリップをはがし、鉗子とヘアループを使用して動物キャップ外胚葉を分離します。両方の外胚葉断片を固定し、MEMFAで胚を制御します 1時間。そして、それらをエタノールに移し、この組織を摂氏マイナス20度で保存します。

ここでは、卵子のセットに、徐々に少数のクローンまたはコロニーに対応するmRNAのプールを注入し、次に動物キャップで培養しました。続いて、初期の神経板段階から小胞形成までの推定水頭外胚葉で通常観察されるマーカーであるfoxe3を発現する各セットの動物キャップの数を決定し、ここで水晶体誘導能力を評価するために使用しました。この方法は、核因子をコードする遺伝子ldb1で同定され、評価された動物の上限の179のうち50、または28%でレンズ誘導応答を生成することができます。

ここに示されているのは、ldb1を注入した卵母細胞を約ステージ11からステージ23まで培養した動物キャップ内のfoxe3シグナルを矢印で示したin situハイブリダイゼーション画像です。foxe3の発現は、未注入卵子上に置かれた対応する対照動物キャップでは観察されません。これらの動物キャップから切片を生成したところ、外胚葉の内側と外側の両方の層でfoxe3の発現が観察されました。

内層での表現は、レンズの応答特性です。または、両方の層で示されているように、嗅覚プラコードなどの他の構造を示しています。この手順に続いて、免疫組織化学、in situハイブリダイゼーション、または蛍光レポーター遺伝子の直接検出などの方法を実施して、動物キャップ外胚葉の誘導応答を評価することができます。