サルヴィとTOF-SIMSによる水中で水和タンパク質のその場キャラクタリゼーションで

本手順の目的は、液体真空界面分析システムおよび飛行時間型二次イオン質量分析法を用いて、水溶液中の吸着タンパク質膜を特性評価することである。本手法は、バイオ分子およびバイオ界面に関する重要な課題を解決するのに有用である。例えば、固体表面における吸着タンパク質の特性評価などが挙げられる。

本手法の主な利点は、液体環境内でバイオ分子をin situで開始でき、分子マッピングと組み合わせることが可能である点にあります。この方法は、固液界面におけるバイオ分子に関する知見を提供できるだけでなく、単一の癌細胞の調査、薬物相互作用、バイオフィルムの付着など、他のシステムにも適用可能です。5 mLのシリンジに、70%エタノール溶液を2 mL採取します。

シリンジをSALVIデバイスの入口端に接続し、1 mLの液体を10分かけてゆっくりと注入します。注入後、シリンジを取り外し、ポリエーテルエーテルケトン（PEEK）ユニオンを用いてSALVIの入口と出口を接続します。室温で4時間、SALVIマイクロチャネル内を70% ethanol溶液で満たした状態に保持します。

次に、2本目のシリンジに滅菌脱イオン水を充填します。これをSALVIの入口に接続し、10分かけてゆっくりと脱イオン水をデバイス内に注入します。シリンジを取り外し、デバイスの入口と出口を再び互いに接続します。

タンパク質膜を固定するために、まず2 mLのフィブロネクチン溶液をシリンジで吸い取ります。シリンジをSALVIデバイスの入口に接続し、1 mLの液体を10分かけてゆっくりと注入します。その後、シリンジを取り外し、再び入口と出口を再接続します。

装置を清潔な培養皿に入れ、室温で12時間インキュベートします。インキュベート後、1 mLの滅菌脱イオン水を10分間かけてゆっくりと注入し、その後、入口を出口に再接続します。まず、ToF-SIMSステージを平坦で清潔な面に置きます。

シリコンウェハと窒化シリコン膜を上に向けて、SALVIデバイスをステージ上に置きます。4つの金属クランプを用いてSALVIデバイスをステージに固定し、デバイスの角を保持している金属片を4本のネジで金属プレートに締め付けます。次に、マイクロ流路に接続されたPTFEチューブをゆっくりと丸めてまとめます。

4つの金属片と4本のネジを使用して、硬い部分を固定します。分析中に一次イオンビームを妨げないよう、デバイスがステージ上のオープンスペースに配置されていることを確認してください。次に、ネジを使用してファラデーカップをステージに取り付けます。

次に、ToF-SIMSのロードロックドアを開き、ステージをローディングプラットフォーム上に水平に設置してからドアを閉じます。真空ポンプを起動し、ロードロックチャンバーを10⁻⁶ mbar程度まで排気します。その後、真空状態が安定した約30分後に、SALVIデバイスをメインチャンバーへ移動させます。

メーカーの推奨プロトコルに従い、ToF-SIMSの一次イオンビームとアナライザーを調整し、約400 nanometersの空間分解能を得ます。次に、光学顕微鏡を用いてマイクロ流路を確認します。光学像の中心を基準とし、それが二次イオン像の中心と一致するように調整します。

このステップは、サンプルが通常の固体サンプルよりも厚く、チャンネルの最適なフォーカスを見つけるための設定調整が困難であるため、習得が難しく、視覚的な実演が極めて重要です。各測定の前に、1 keVの酸素ビームを用いて窒化シリコンウィンドウ上を約15秒間スキャンし、表面汚染を除去してください。また、すべての測定において、表面チャージを補償するために電子フラッドガンを使用してください。

次に、データ収集を開始する前にポジティブモードまたはネガティブモードを選択します。すべての測定において、一次イオンビームとして25 keVのBi₃⁺を使用してください。深さ方向プロファイリングでは、直径約2 µmの円形領域を32×32ピクセルの解像度でスキャンします。

窒化シリコン膜の貫通に要する時間を最小限にするため、パルス幅の長い一次イオンビームを使用してください。窒化シリコン膜を貫通させた後、2次元画像再構成に十分なデータを取得するため、約 200 secondsの間、同一の電流を維持します。データ収集の際は、より高い質量分解能でスペクトルを取得するため、パルス幅を 80 nanosecondsまで短縮してください。

このデータ収集をさらに約200秒間継続します。SALVIマイクロフルイディクス・インターフェースを用いることで、一次イオンビームを水和したフィブロネクチン膜に直接照射させることができます。ToF-SIMS質量分析データにより、多数の水クラスターおよびアミノ酸断片が示されています。

これにより、水和したタンパク質分子の周囲および内部にある水分子の特性に関する直接的な証拠が得られます。ここでは、水和フィブロネクチン膜と脱イオン水の深さ方向プロファイルの時系列データを確認できます。窒化シリコン膜がパンチングされる前は、選択された二次イオンの強度は無視できるレベルです。

窒化シリコン膜が貫通すると、二次イオンの強度が大幅に増加します。画像およびスペクトルの再構成において、より高い質量分解能でデータを得るために、短パルス幅プロセスが使用されます。水和したフィブロネクチン膜および脱イオン水から得られた2D画像は、試料から検出された特定の二次イオンのカウント数を示しています。

画像が明るいほど、二次イオンカウントが高くなります。これらの直感的な画像により、異なるサンプル間での選択的な二次イオンの明確な比較が可能となり、データ解析に有用です。この手順を行う際は、真空チャンバーに設置する前にマイクロリアクターに漏れがないことを確認することが重要です。

この手法は、生物学およびバイオインターフェース分野の研究者が、タンパク質の吸着、バイオフィルムの付着、表面自己組織化単分子膜、およびその他の多くの現象を探索する道を切り開きました。このビデオを視聴することで、SALVIおよび液体ToF-SIMSを用いてさまざまな液体試料を研究する方法について、十分な理解を得ることができます。