脱細胞肺足場を使用してESC由来のマウス気道上皮細胞の生成
2016年5月5日
このプロトコルは、効率的に気道上皮細胞を成熟するために、マウスの胚性幹細胞由来の胚体内胚葉を指示します。この分化技術は、定義された、無血清培養の設定において、肺系統の仕様を指示するために3次元の脱細胞化肺足場を使用します。
この手順の全体的な目標は、マウス胚性幹細胞の成熟気道上皮細胞への分化を、脱細胞化肺スキャフォールドでセットアップされた3D培養を使用して、進行させることです。この方法は、細胞マトリックスの収縮や肺の系統分化における成長因子シグナル伝達の役割など、肺の発生分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、定義された無血清環境で3D培養システムを使用し、他の内胚葉系統からの汚染を抑えながら、気道上皮の強固な分化を実現できることです。成体のウィスターラットを安楽死させた後、テキストプロトコルに従って、前足と後足を固定して動物を解剖面に固定し、70%エタノールを使用して胸部と腹部にスプレーします。胸郭のすぐ下に切開部を作成します。皮膚を切り取り、横隔膜を露出させます。次に、横隔膜に小さな切開を行い、肺を引っ込めて肺に穴を開ける可能性を減らします。次に、胸骨に沿って垂直に切開し、胸腔を開いて心臓と肺にアクセスします。次に、縫合糸で下大静脈を結紮し、小さな解剖ハサミを使用して左心房に小さな切開を挿入します。ヘパリン処理されたハンクスバランス塩溶液で満たされた25ゲージの針を備えた準備された10mlシリンジを使用して、針を右心室に挿入して肺灌流を開始し、緩衝液を肺循環に押し込みます。肺が白くなり、左心房から流れる液体が透明になるまで灌流を続けます。灌流後、気管を露出させ、カニューレ挿入のために甲状軟骨の近くに小さな切開を行います。次に、プラスチック製のカテーテルを使用して気管をカニューレし、縫合糸を使用して気管を所定の位置に固定します。次に、10mlのシリンジをレトルトスタンドとクランプに固定して、重力灌流システムを設定します。次に、シリンジプランジャーを取り外して廃棄します。シリンジバレルの最大充填点を肺の20cm上に固定し、シリンジの端に双方向ストップコックを取り付け、ストップコックのもう一方の端に長いプラスチックチューブを取り付けます。カテーテルを気管からそっと引き出し、プラスチックチューブの端に取り付けます。次に、脱細胞化溶液をシリンジに注ぎ、溶液が付属のプラスチックチューブとカテーテルを完全に満たすようにします。溶液で満たされたカテーテルを気管に戻し、1分間総肺活量まで充填して肺を洗浄します。次に、カテーテルを気管から取り外して、液体が肺から流れ出るようにします。脱細胞化溶液で肺の洗浄を8回繰り返し、続いてPBSで10回すすぎます。肺は、洗浄ステップの完了とともに白く見えます。次に、首と胸腔から気管と肺を解剖します。食道や心臓など、解剖した肺から余分な組織を取り除き、ビブラトーム切片の準備が整うまで肺を冷たいPBSに移します。厚い切片を調製するには、PBS中に約15mlの2%および4%の低融点アガロースを作成し、すべてのローブを小さな長方形のブロックに埋め込むのに十分な6%アガロースを作成します。アガロースを15mlチューブに移した後、チューブをヒートブロックに置き、ゲル化を避けるために温度を摂氏40度以上に保ちます。小さなハサミを使用して、各葉気管支の端にある脱細胞化肺を解剖し、各葉を剥離します。次に、吸収シートを使用して余分なPBSを取り除き、ローブを加熱ブロックの2%アガロースに5分間移して組織をコーティングします。各ローブをシャーレに移した後、ディッシュをコールドプレートに置き、表面を1分間ゲル化させます。ローブを4%アガロースに静かに置き、5分間インキュベートして冷却した後、6%アガロースでコーティングを繰り返します。コーティング後、金属ベース型を使用して各ローブを6%アガロースに別々に埋め込み、少なくとも3mlのアガロースが端から組織を囲みます。次に、鉗子を使用して、実験者に面する金型の表面に組織の最大の平らなエッジを配置して各葉を向き、プラスチックカセットを使用して埋め込みを完了します。ビブラトーム切片化する前に、ブロックをコールドプレート上で少なくとも30分間ゲル化させます。あるいは、ビブラトーム切片を作成する前に、ブロックを摂氏4度で最大12時間加湿チャンバーに保管します。切片を準備するには、切片化チャンバーに冷たいPBSを充填してビブラトームをセットアップします。セクショニング全体で低温を維持するために、周囲にアイスバスを設置します。次に、金属金型からブロックを取り外し、かみそりの刃を使用して、組織の端から約3ミリメートルを保ちながら、葉を囲む余分なアガロースを切り取ります。接着剤を使用して、組織を標本プレートの中心に固定し、プレートをPBS充填切片チャンバーに沈めます。セクショニングブレードをビブラトームにロードします。ビブラトームのセクショニング境界を設定するには、速度、振幅、厚さの値をそれぞれ選択します。各ローブを完全に切断し、セクションが互いに完全に分離していない場合は、小さなハサミを使用して手動でセクションを切断します。次に、足場切片をそっと集め、冷たいPBSに移します。鉗子を使用して、各セクションを周囲のアガロースから静かに解放します。足場切片を除染するには、足場切片をPBSから微量遠心チューブに移した後、PBSにヌクレアーゼ1ミリリットルあたり90単位を加え、ローテーター上で室温で12〜24時間インキュベートします。テキストプロトコルに従って、切片を新しい微量遠心チューブに移した後、無菌条件下で抗菌溶液を加え、室温でローテーター上で6時間インキュベートします。次に、無菌条件下で、PBSを使用して足場を2回すすぎ、細胞を播種する前に無血清培地(SFDM)に移します。気液界面培養をセットアップするには、滅菌鉗子を使用して、ペトリ皿に疎水性メンブレンを配置します。次に、SFDMから各脱細胞化した足場切片をメンブレンに移し、切片がメンブレン上に均等に広がるようにします。ウェルプレートを6枚または12枚、それぞれ1mlまたは0.5mlのSFDMでウェルを充填します。次に、メンブレンをウェルにそっと置き、メンブレンを培地の上に浮かべて、空気液体培養のセットアップを作成します。内胚葉細胞の調製と蛍光活性化細胞の選別に続いて3Dスキャフォールドを播種し、最終的な内胚葉を濃縮するには、血球計算盤を使用して選別された細胞をカウントします。その後、細胞を400Gで5分間スピンダウンします。SFDMを使用して、ペレット化した細胞を約100,000個の細胞に10個に再懸濁します
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概要
本プロトコルでは、マウス胚性幹細胞由来の定常内胚葉を、成熟した気道上皮細胞へと効率的に分化させます。この分化手法では、血清不含の規定培地条件下で、3次元脱細胞化肺スキャフォールドを用いて肺系譜への分化を誘導します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 幹細胞生物学
- 肺の発達
- 組織工学
背景
- マウス胚性幹細胞は、さまざまな細胞型へと分化することができる。
- 決定的な内胚葉は、肺上皮細胞の前駆細胞である。
- 3Dスキャフォールドは、より良好な分化を実現するために肺環境を模倣することができる。
- 制御された分化には、無血清培養条件が不可欠である。
研究目的
- 幹細胞を肺上皮細胞へ効率的に分化させるためのプロトコルを開発する。
- 細胞運命を制御するために、脱細胞化肺スキャフォールドを利用する。
- 幹細胞分化のための規定の培養環境を構築する。
使用方法
- マウス胚性幹細胞の単離。
- 無血清培地での細胞培養。
- 3D脱細胞化肺スキャフォールドの利用。
- 気道上皮細胞への分化の評価。
主な結果
- 幹細胞から成熟した気道上皮細胞への分化に成功した。
- 分化した細胞の特性評価により、肺系統への特異化が示された。
- 3Dスキャフォールドにより、分化プロセスの効率が向上した。
- 定義された培養条件により、細胞の成熟が促進された。
結論
- このプロトコルは、幹細胞から肺上皮細胞を生成するための信頼性の高い手法を提供します。
- 3Dスキャフォールドは、肺系譜への分化誘導に効果的です。
- 無血清条件は、制御された分化を促進するために有益です。
よくある質問
産業上の重要性
肺上皮細胞の分化をin vitroで再現することは、呼吸器系の創薬や疾患モデリングにおいて依然として重要な課題です。本プロトコルでは、脱細胞化肺スキャフォールドを利用して、胚性幹細胞からマウス気道上皮細胞を生成し、疾患に関連した気道モデルの明確で再現性があり、かつスケーラブルな作製を可能にします。この手法は、嚢胞性線維症などの気道疾患に対するトランスレーショナルリサーチおよび前臨床スクリーニングを支援します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 気道上皮の系統決定および細胞-マトリックス相互作用の解析を可能にします。
- 生理学的に関連のある3Dコンテキストにおける機能的なターゲット検証をサポートします。
- 気道疾患ターゲットのメカニズム的なリスク低減を促進します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 化合物のスクリーニングに適した、再現性のある無血清気道上皮系を提供します。
- 繊毛細胞、クラブ細胞、および基底細胞集団に対する薬物効果の定量的な評価を可能にします。
- ハイコンテンツスクリーニングプラットフォームにおけるアッセイの標準化と拡張性をサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- トランスレーショナルなバイオマーカー研究に向けた、疾患に関連する気道上皮モデルを提供します。
- 気道標的治療薬の探索と前臨床検証の橋渡しを行います。
- 前臨床での有効性および毒性評価における生物学的な不確実性を低減します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、標的の検証、スクリーニング、およびトランスレーショナルリサーチのための定義された気道上皮プラットフォームを提供することにより、創薬から前臨床に至る一連のプロセスに組み込まれます。
- 探索生物学：気道系の系統決定および細胞-マトリックスシグナリングに関する仮説検証を支援します。
- スクリーニング：気道モデルにおける化合物評価のための、再現性と定量性のあるアウトプットを提供します。
- 分析：分化効率および細胞組成の測定を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：気道病変の疾患モデリングのニーズに適合しています。
- エンタープライズでの再利用：標準化され、再利用可能な気道上皮分化ワークフローを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 気道疾患モデルの予測精度およびターゲット検証の信頼性を向上させます。
- 運用的価値： 気道細胞作製における再現性、拡張性、およびコスト効率を促進します。
- 戦略的価値： 気道を標的とした候補薬のgo/no-go決定を改善します。
- ポートフォリオへの影響： 呼吸器系プログラムのリスク調整済み優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- 幹細胞分化および3D組織工学に関する専門知識が必要です。
- 脱細胞化肺スキャフォールドおよび気液界面培養システムへのアクセスが必要です。
- 再現性のある結果を得るためには、チーム間での標準化が求められます。
- 他の種や疾患モデルに適応させる場合、プロトコルの最適化が必要になることがあります。
- 気道上皮細胞集団に限定されており、肺胞細胞は生成されません。
