ヒト胆汁からマイクロRNA含有エキソソームの単離とプロファイリング

この方法の全体的な目標は、マイクロRNAプロファイリングを含むさらなる分析のために、ヒトの胆汁からエキソソームを単離することです。この方法は、胆管癌やその他の胆道疾患の特定の胆汁マーカーの検出など、肝疾患分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、堅牢で再現性が高いことです。

内視鏡的逆行性胆管膵管造影術(ERCP)を実行するには、まず患者を仰臥位に置くことから始めます。挿管し、十二指腸鏡を患者の口に通した後、十二指腸の 2 番目の部分に挿入し、主要な乳頭を特定します。0.35インチまたは0.9ミリメートルの親水性ガイドワイヤーがプリロードされたトリプルルーメン括約筋切開を挿入することにより、総胆管を選択的にカニューレします。

透視ガイドの下で、ガイドワイヤーを左肝管まで進め、次に括約筋切開を胆管に5センチ進めて安定した位置を取得します。ガイドワイヤーを取り外した後、下部ロックを介してガイドワイヤーポートに10mmシリンジを取り付け、10ミリリットルの負圧を使用して胆汁を吸引します。胆汁の入ったシリンジを取り外し、ガイドワイヤーを再度挿入した後、注入口から造影剤を注入して胆道樹を混濁させます。.

次に、収集した胆汁を氷上の15ミリリットルのチューブに移し、後で保存する場合は、サンプルを500 g、摂氏4度で10分間遠心分離した後、摂氏マイナス80度で凍結します。すぐにエクソソームの単離を進めるには、400マイクロリットルの胆汁を微量遠心チューブに移し、300倍g、摂氏4度で10分間遠心分離して細胞と細胞破片を回収します。上清をさらに透明にするには、溶液を新しい微量遠心チューブに移し、サンプルを16、500倍g、摂氏4度で20分間遠心分離します。

次に、バイオセーフティキャビネットで上清をシリンジに集め、0.2マイクロメートルのポリエーテルスルホン膜フィルターでろ過して、200ナノメートルを超える残りの粒子を除去します。ろ過した上清を超遠心チューブに移し、PBSを使用してチューブを少なくとも3分の2まで満たし、遠心分離中にチューブが崩壊するのを防ぎます。エクソソームを120,000倍のgおよび摂氏4度で70分間超遠心分離することによりペレット

小さな黄色のペレットにはエキソソームが含まれています。慎重にデカンテーションして上清を捨て、最終濃度の10%体積まで漂白剤を追加して廃棄物を消毒します。その後、20分間放置します。

下流の実験では、ペレットを少量の適切な溶液で処理するか、50〜100マイクロリットルのPBSに再懸濁して、将来の使用のために摂氏マイナス80度で保存します。テキストプロトコルに従って、造影剤染色された細胞外小胞、またはEVのグリッドを準備した後、粒子のサイズを決定するときに、20, 000 Xの倍率で開始し、100, 000 Xに増加する80キロボルトの加速電圧を使用して電子顕微鏡で画像を取得します。エクソソームは小さすぎて、通常の顕微鏡検査やフローサイトメトリーで検出できません。ただし、この図は、この分離されたヒト胆汁サンプルの平均97ナノメートルの濃度とサイズ分布を測定するエキソソームの典型的なナノ粒子追跡分析(NTA)の結果を示しています。

電子顕微鏡法は、ヒトの胆汁中の単離粒子のサイズを確認するためにも使用でき、この図は典型的な透過EM結果を示しています。これらのウェスタンブロットは、テトラスパニンCD63やTsg101などのエクソソームが豊富なタンパク質についてプローブされました。このリアルタイム増幅プロットは、ヒト胆汁のエキソソームから抽出されたさまざまなマイクロRNA種を示しています。

エクソソームには18Sまたは28SリボソームRNAやハウスキーピング遺伝子のような信頼性の高い標準がないため、合成マイクロRNAのスパイクはノーマライゼーションに重要です。エクソス単離技術は、適切に実行されれば3時間で完了します。このビデオを見れば、患者や動物から胆汁を採取して処理し、細胞外小胞を分離して分析する方法を十分に理解できるはずです。

この手順を撤回する一方で、超遠心分離を続行できない場合は、サンプルを500 Gで4度遠心分離してから、マイナス80度で凍結することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、マイクロRNAプロファイルのような追加の質問に答えるために、マイクロRNA研究のような他の方法を実行することができます。胆汁の取り扱いは肝炎を含む可能性があるため非常に危険である可能性があり、この手順を実行するときは常に手袋や安全メガネの着用などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。

その開発後、この技術は、PSAの閉塞などの胆道の問題を抱える患者の胆汁の潜在的なバイオマーカーとして細胞外小胞を調査するための胆管癌研究の分野における研究への道を開きました。