核酸の濾過単離：簡易迅速DNA抽出方法

このFINA法の全体的な目標は、核酸のろ過単離の略で、遠心分離機などの実験室の機器を使用せずに、複雑な検体からPCR増幅用のゲノムDNAを迅速かつ簡単に分離することです。HIV proウイルスDNAのこの迅速な紙ベースのDNA抽出法は、定量的PCR診断デバイスに組み込むために開発されました。この手法の主な利点は、サンプル調製モジュールとPCRチューブを事前に準備できるため、DNA抽出にかかる時間が2分未満であることです。

私たちは最初に、かかと棒の血液からHIV-1の早期乳児診断テストに答えるためのサンプルに組み込むためにこの方法を開発しました。一般に、この方法に不慣れな人は、細胞捕捉膜をPCRチューブの側面に固定している両面テープの裏地を取り外すのに練習が必要なため、苦労する可能性があります。手順を実演するのは、私の研究室の上級技術者であるJen Reedです。

この手順は、FINAサンプル調製モジュールの組み立てに必要な材料を準備することから始めます。厚さ2.6mmの綿100%のパッドを35×35mm四方にカットして、吸い取りパッドを準備します。紙の裏紙テープでプラスチックパラフィンフィルムを準備します。

25 x 50 mm のパラフィンフィルムをカットし、ハンマーを使用してテープの中央に直径 7.14 mm の穴を開けます。ハンマーを使用して直径8.35mmの円を打ち抜き、結合したガラス製血液分離膜またはキャプチャディスクを準備します。FINAサンプル調製モジュールを組み立てるには、鉗子を使用してキャプチャディスクをブロッティングパッドの中央に置きます。

パラフィンフィルムテープの裏地をはがし、キャプチャディスクの上に置きます。パラフィンテープをわずかに伸ばしてブロッティングパッドを覆い、パラフィンテープをしっかりと押してディスクのすべての端をブロッティングパッドに貼り付けることで、ディスクとブロッティングパッドとの接触を最大限に高めます。キャプチャメンブレンをqPCRチューブの側面に固定するには、5.1 mmのテープディスクが必要です。メンブレンがリアルタイムPCR装置の蛍光検出をブロックしないようにします。

このテープディスクを準備するには、ハンマーを使用して、テープのシートから二重コーティングされたポリエステル診断テープの円を打ち抜きます。鉗子を使用して、テープステッカーライナーの片側を取り外します。テープを200マイクロリットルのPCRチューブに入れ、チューブの片側と底に向かって貼り付けます。

2枚目のステッカーライナーをはがします。これで、チューブは準備されたディスクを受け取る準備が整いました。このビデオでは、8e5 LAV細胞をスパイクした全血からのプロウイルスDNAの検出を実演します。

以前に凍結した8e5 LAV細胞ペレットを氷上で解凍します。1マイクロリットルあたり1〜400個の細胞の濃度の凍結培地で細胞の段階希釈液を調製します。各希釈液から10マイクロリットルの細胞をマイクロ遠心チューブにピペットで移します。

100マイクロリットルの新鮮なHIV-1陰性eDTA処理全血サンプルを各チューブに追加して、標準曲線を作成します。チューブの底を5回軽くはじいて混ぜます。DNA抽出手順を開始するには、トリトンX-100を最終濃度1%まで添加して血球を溶解します。

チューブの底を5回軽くはじいて混ぜます。血液は半透明の赤に変わります。血液検体全体をキャプチャディスクにピペットで移します。

パラフィンテープと捕捉膜との間の水密シールにより、血液が膜を通って流れるようになります。また、コンタクトメンブレンとブロッティングパッドアセンブリとの良好な接触により、迅速なサンプルウィッキングが保証されます。サンプルをフィルターに染み込ませます。

血液溶解物がキャプチャディスクに染み込み、ディスクがマットに見えます。600〜1, 000マイクロリットルの10ミリモルの水酸化ナトリウムをキャプチャディスクに滴下します。フィルターが赤から白に変わり、ヘモグロビンのクリアランスを示します。

次に、ディスクをブロッティングパッドから分離し、準備したPCRチューブのテープにディスクを貼り付けます。フィルターをPCRチューブに入れた後、すぐにサンプルを分析します。プロトコールテキストに記載されているようにqPCRマスターミックスを調製し、フィルターがマスターミックスで完全に覆われ、反応全体を通してチューブの側面に固定されたままであることを確認してください。

プロトコールテキストに記載されているように、リアルタイムPCRデバイスを使用して増幅を行います。あるいは、qPCRをすぐに実施できない場合は、硫酸カルシウム乾燥剤の入ったボックスでフィルターを一晩乾燥させます。翌日、PCRチューブにキャップをして、シリカ乾燥剤を入れたホイルパウチに入れ、分析の準備が整うまで室温で保存します。

この方法により、8e5 LAV細胞から異なるコピー数でHIV-1プロウイルスを効率的に増幅することができます。実線は、内部コントロールの反応ごとに 500 コピーの 4, 000、400、40、および 10 個の 8e5 LAV 細胞をスパイクした HIV-1 陰性全血の 4 回の複製から得られた増幅プロットです。点線はしきい値を示します。

このグラフは、全血 100 マイクロリットルあたり 8e5 LAV 細胞のコピー数vs. log増幅プロットから計算された定量サイクル値の標準曲線を示しています。計算されたPCR効率は103%でしたHIVプロウイルスDNA標準曲線複製も再現性の高い増幅を持っています。

さらに、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼの500コピーの内部コントロールの存在は、存在するHIV-1プロウイルスのコピー数とは無関係に、この方法で血液を抽出することに起因するPCR阻害がないことを示しています。実線は増幅プロットを表し、点線はしきい値を表します。この手順により、さまざまな検体タイプからPCRターゲットを増幅して、目的の遺伝子を検出することができます。

例えば、薬理遺伝学的スクリーニングのための頬スワブや、動物モデルの迅速なジェノタイピングのための血液などです。血液媒介性病原体を扱うことは非常に危険であり、この手順を実行する際には常に普遍的な予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。